三、聚合酶鏈反應(yīng)
1988年Higuchi等報(bào)道,可以從人的單根毛發(fā)的毛囊細(xì)胞中抽提DNA,并結(jié)合運(yùn)用DNA聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)技術(shù),分析了單根毛發(fā)細(xì)胞中抽提的線粒體DNA的D環(huán)區(qū)(D-loop region)的“DNA”指紋圖”。
PCR技術(shù)由Mullis等首創(chuàng)(詳見第二十二章 )。它又稱為DNA體外擴(kuò)增技術(shù),是用DNA聚合酶在體外擴(kuò)增一段DNA順序達(dá)百萬倍以上。這樣就可直接觀察而不用印跡雜交法。這項(xiàng)技術(shù)的基本原理是,將有待擴(kuò)增的DNA分子加熱變性成為單鏈,然后加入按欲擴(kuò)增DNA片段兩端核苷酸順序合成的一對(duì)引物和耐高溫的DNA聚合酶,這樣就可以單鏈DNA分子為模板合成了它的互補(bǔ)鏈。接著再加熱使DNA雙鏈解鏈。由于這類DNA聚合酶是耐高溫的,所以在熱變性處理后仍保持酶活性,在有引物分子存在的條件下又繼續(xù)合成該DNA片段。如此循環(huán)往復(fù)20~30多個(gè)周期,微量的DNA分子可增加10萬~100萬個(gè)拷貝。
這種技術(shù)在醫(yī)學(xué)上有很大的用途。先是Saiki等(1985)將其用于鐮形表細(xì)胞性貧血的快速診斷。繼而Chehab等將其用于Barts胎兒水腫綜合征的前診斷(缺失純合型)。我國(guó)吳冠蕓、曾溢滔、蔡仕萍、張基增等在不同實(shí)驗(yàn)室將PCR結(jié)合寡核苷酸探針法用于已知點(diǎn)突變的β地中海貧血的產(chǎn)前診斷,并不斷簡(jiǎn)化技術(shù)。目前PCR技術(shù)已用于許多疾病的診斷及產(chǎn)前診斷(如血友病、假肥大性肌營(yíng)養(yǎng)不良、α1抗胰蛋白酶缺乏癥、艾滋病等)。原則上已知DNA順序的基因及突變性質(zhì)的遺傳病都可以應(yīng)用此技術(shù)。此外,PCR還可用于直接做DNA順序分析。