流式細(xì)胞術(shù)對外周血白細(xì)胞的免疫熒光分析

　　3．雙染色分析游標(biāo)設(shè)立和熒光校正

　�。�1)游標(biāo)的設(shè)立：游標(biāo)設(shè)立的原理和單染并無不同，但具體要用二維點(diǎn)圖和二維等高圖來完成。分別選用GFL和RFL為X和Y軸。先用不染色細(xì)胞測試，將陰性細(xì)胞集中在左下角（圖10-13)。分別為X、Y軸設(shè)立游標(biāo)，再用MsIg的陰性對照測試。可將X、Y軸游標(biāo)略為移動，使位于窗“3”內(nèi)的細(xì)胞（陰性)在95%以上。

　�。�2)紅、綠熒光的校正：由于紅色熒光探測器在最佳測試狀態(tài)時，會讓部分綠色熒光進(jìn)入紅色熒光探測器。這是因?yàn)橐徊糠旨?xì)胞發(fā)出的綠色熒光波長較長。若用阻斷或?yàn)V色的辦法消除進(jìn)入紅熒光探測器的這部分GRL，就會大大地降低RFL探測器的靈敏度。因而只好在操作時，通過電子計(jì)算機(jī)預(yù)先進(jìn)入熒光校正，在RFL中適當(dāng)扣除GRL的影響。

　　通常紅色熒光進(jìn)入綠色熒光探測器的情況比較光見，圖10-14給出CD₁₁-PE（T細(xì)胞、RFL)及CD₈-FITC（T抑制細(xì)胞，GFL)雙染細(xì)胞在二維等高圖上進(jìn)行熒光校正的示意圖。X軸為GFL，Y軸為RFL，由X軸Y軸游標(biāo)劃分的四個窗的陰陽性和圖10-13相同。各窗給出的百分?jǐn)?shù)為該細(xì)胞群所占百分比。圖A表示未經(jīng)校正時的情形。窗“2”內(nèi)31.46%表示雙陽性細(xì)胞，即在T細(xì)胞中31.46%為抑制細(xì)胞毒細(xì)胞。經(jīng)過適當(dāng)校正，可見有兩群陽性雙標(biāo)記細(xì)胞出現(xiàn)（B圖)。高強(qiáng)度部分為真正的CD₈、CD₁₁雙標(biāo)記陽性細(xì)胞；低強(qiáng)度部分屬于CD₈綠色陽性細(xì)胞（NK細(xì)胞)。此時“2”窗中細(xì)胞份額減為7.59%。需要指出的是校正過度則會使各區(qū)的陽性細(xì)胞都減少（圖C)。

圖10-13　雙染色二維點(diǎn)圖上游標(biāo)的設(shè)置

1區(qū)：紅色熒光陽性；2區(qū)�。杭t、綠熒光均為陽性；3區(qū)：陰性細(xì)胞：4區(qū)：綠色熒光陽性細(xì)胞

圖10-14雙染色在二維等高圖上熒光校正

　　雙染色的熒光校正是用電子補(bǔ)償電路來完成的。補(bǔ)償時先測定一種染料的熒光，此時除了應(yīng)該接收該熒光的光電倍增管PMT₁有信號輸出外，另一光電倍增管PMT₂也常會有微弱輸出。調(diào)節(jié)　補(bǔ)償器使PMT₂的輸出為0；然后再測另一種波長的熒光染料，調(diào)PMT_１的補(bǔ)償器使之輸出也為0；然后再測另一種波長的熒光的染料，調(diào)PMT₁的補(bǔ)償器使之輸出也為0：如此反復(fù)調(diào)節(jié)　，使兩種熒光的探測器都獲得補(bǔ)償。實(shí)際調(diào)節(jié)　時用的是一種標(biāo)準(zhǔn)熒光微球，微球上標(biāo)有已知數(shù)量的熒光分子。利用不同的微球可調(diào)整、補(bǔ)償不同熒光的測量通道。需要指出的是：當(dāng)PMT高壓有所改變、激光和濾片系統(tǒng)有所變動時，都要對熒光校正做重新補(bǔ)償調(diào)節(jié)　。

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