用PCR-SSCP區(qū)分不同來源的幽門螺桿菌

　　幽門螺桿菌（Hp)感染在人群中廣泛存在，Hp的分型鑒定對(duì)其感染的臨床及流行病學(xué)研究具有重要意義。國外文獻(xiàn)報(bào)道的幾種基因型技術(shù)使Hp的分型鑒定成為可能，而PCR及單鏈構(gòu)象多態(tài)性（Signle-strand conformation polymorphisms,SSCP)分析在菌株分型鑒定中的應(yīng)用則尚未見報(bào)道。作者采用PCR-SSCP分析區(qū)分不同來源的Hp，并探討其應(yīng)用價(jià)值。

　　1 材料和方法

　　1.1 菌株來源 Hp標(biāo)準(zhǔn)菌株NCTC11637，NCTC11848來自英國倫敦國家標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)物收藏中心，由本院傳染科保存并提供；112株臨床分離鑒定的Hp來自97名因上胃腸癥狀在本院行胃鏡檢查的病人，經(jīng)內(nèi)鏡及病理診斷證實(shí)十二 指腸潰瘍49例，胃潰瘍5例，慢性胃炎43例。所有病人在內(nèi)鏡直視下于胃竇取粘膜活組織一塊做細(xì)菌培養(yǎng)，其中包括1例未經(jīng)治療相融8個(gè)月復(fù)查胃鏡者，4名病人還另于胃底或十二指腸球部取粘膜活組織一塊做細(xì)菌培養(yǎng)，10例十二指腸潰瘍伴Hp感染者于抗生素治療停藥4周復(fù)查胃鏡，取胃竇粘膜活組織兩塊分別做細(xì)菌培養(yǎng)及PCR方法直接檢測(cè)Hp。

　　1.2 模板DNA的準(zhǔn)備 培養(yǎng)細(xì)菌或研碎的活檢胃粘膜以1%SDS100μg/ml蛋白酶k，55°C消化1h，以等體積苯本分氯仿-異戊醇（25:24:1)抽提，12000rpm離心10，吸取上層水相，加2.5倍體積冷無水乙醇12，000rpm離心10min沉淀DNA，以100μl無離子溶解DNA，1μl用于PCR擴(kuò)增。

　　1.3 PCR擴(kuò)增Hp基因組 DNA203bp片段PCR引物CAM-2:5’-CATCTTGTTA-GAGGGATTGG-3’CAM-4:5’-TAA-CAAAAAGATAATGGCGC-3’，已證實(shí)對(duì)HpDNA特異，擴(kuò)增片段長度為203bp。50μl含10mMTris(pH8.3),50mM KCL,1.5mM Mgcl2,0.01%明膠，各200μdNTP，各0.5μM CAM-2/CAM-4引物，1.25U TaqDNA聚合酶（中科院遺傳所產(chǎn)品)。反應(yīng)條件：94°C5min,1個(gè)循環(huán)；94°C1min,55°C1min,72°C1.5min,35個(gè)循環(huán)；72°C10min，1個(gè)循環(huán)。以HpNCTC11637DNA為陽性對(duì)照，去離子水做陰性對(duì)照。

　　1.4 PCR產(chǎn)物的SSCP分析 PCR產(chǎn)物2μl以0.1M NaOH 2mM EDTA37°C變性10min,加3μl電泳加樣緩沖液（95%甲酰胺、0.5×TBE、0.25%溴酚藍(lán)、0.25%二甲苯腈藍(lán))混勻，于7.5%聚丙烯酰胺膠室溫電泳300V，3.5min，以0.19%硝酸銀染色30min，經(jīng)顯色液（1.5%NaOH,0.5%甲醛，0.0085%硼氰化鈉)顯色后觀察結(jié)果，比較不同Hp菌株兩條單鏈DNA片段的遷移情況。

　　2 結(jié)果

　　2.1 PCR-SSCP方法的重復(fù)性 相隔半年轉(zhuǎn)種得到5對(duì)Hp菌株，每對(duì)菌株203bpPCR產(chǎn)物的SSCP分析均顯示完全相同的單鏈構(gòu)象；同一菌株203bp PCR產(chǎn)物在不同聚丙烯酰胺膠上都呈現(xiàn)相同的單鏈構(gòu)象，使不同凝膠上菌株的PCR-SSCP分析具有可靠性。

　　2.2 Hp基因組DNA203bp片段SSCP分析 不同Hp菌株203bp片段變性后的兩條單鏈，在中性聚丙烯酰胺膠中電泳的遷移率不同，從而形成不同的單鏈構(gòu)象。來自97名病人的分離菌株及2株標(biāo)準(zhǔn)菌株產(chǎn)生7種不同的單鏈構(gòu)象。通過比較不同的單鏈構(gòu)象。通過比較不同Hp菌株的單鏈構(gòu)象，將這97名病人的菌株分成6組（見表1)。同一病人相隔8個(gè)月分離培養(yǎng)的菌株，其203bpPCR產(chǎn)物的單鏈構(gòu)象穩(wěn)定不變；4個(gè)病人不同培養(yǎng)部位的4對(duì)Hp菌株分別具有相同的單鏈構(gòu)象。

表1 Hp標(biāo)準(zhǔn)菌株來自97名病人的臨床分離菌株的分組情況

　　2.3 治療前后菌株的PCR-SSCP分析10例Hp感染者抗生素治療后停藥1月或1月以上復(fù)查，發(fā)現(xiàn)6例細(xì)菌培養(yǎng)仍為陽性，4例細(xì)菌培養(yǎng)陰性而PCR檢測(cè)仍為陽性。對(duì)這10例病人治療前后菌株的PCR-SSCP分析，發(fā)現(xiàn)9例病人治療前后的菌株具有相同的單鏈構(gòu)象，1例病人治療前后的單鏈構(gòu)象不同。對(duì)其中2例治療后僅PCR為陽性的患者，于停藥5個(gè)月～6個(gè)月復(fù)查時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)菌培養(yǎng)轉(zhuǎn)為陽性，并與治療前菌株具有相同的單鏈構(gòu)象（表2)

表2 10例Hp感染者治療前后菌株的PCR-SSCP分析

　　**B-治療前菌株；A-治療后菌株；a-治療后僅PCR陽性

　　表2中同時(shí)列出不同組別菌株的疾病來源，未發(fā)現(xiàn)不同組別的菌株與某一疾病有確定的關(guān)系，未發(fā)現(xiàn)與十二指腸潰瘍或胃潰瘍密切相關(guān)的Hp菌株。

　　3 討論

　　不同Hp菌株DNA分子具有多態(tài)性，PCR-SSCP分析作為檢測(cè)DNA多態(tài)及基因突變的方法，有可能檢出這一多態(tài)性，從而區(qū)分不同來源的Hp菌株。本研究用PCR-SSCP分析鑒別不同Hp菌株方法簡單、可靠、重復(fù)性好，通過比較97名病人的臨床分離菌株及2株標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組DNA203bp片段的兩條單鏈DNA，在聚丙烯酰胺膠中的電泳遷移率，將這些被檢菌株分成7組，表現(xiàn)出中等度的分辨力。它雖然不能將所有不同病人來源的菌株逐一區(qū)分，但可對(duì)流行病學(xué)上某特定人群的菌株分組從而可以比較不同人群中感染的Hp有無差異。

　　本研究中顯示74%的菌株具有相同的單鏈構(gòu)象，推測(cè)可能是北京市區(qū)人群Hp感染的主要菌型。本結(jié)果還證實(shí)同一病人相隔8個(gè)月分離的菌株，其203bp片段的單鏈構(gòu)象穩(wěn)定不變，這與文獻(xiàn)中報(bào)道的同一病人2年內(nèi)連續(xù)分離的多株Hp，其染色體DNA酶切圖型保持不變的結(jié)果相似。對(duì)來自4名病人不同部位的4對(duì)Hp菌株的PCR-SSCP分析，未發(fā)現(xiàn)同一病人有不同類型Hp菌株的混合感染。Petwett等用Southern印跡法對(duì)來自15個(gè)病人的胃竇、胃體及十二指腸球部的64株Hp核糖型分析，發(fā)現(xiàn)2個(gè)病人分別感染了兩株不同的Hp。本文觀察的病人數(shù)不多，尚難做結(jié)論。

　　對(duì)10名病人治療前后菌株的PCR-SSCP分析，發(fā)現(xiàn)9名病人治療前后的菌株具有相同的單鏈構(gòu)象，認(rèn)為是治療后同一菌株的復(fù)發(fā)。1名病人治療前后的菌株單鏈構(gòu)象不同，可能是治療后獲得了新菌株的再感染，或藥物治療導(dǎo)致原來感染的菌株變異但也不排除兩株不同類型Hp菌株混合感染的可能。PCR-SSCP分析用于治療后Hp復(fù)發(fā)和再感染的鑒別與文獻(xiàn)報(bào)道相類似，但由于不同Hp菌株也可有相同的SSCP圖型，使該方法對(duì)治療前后菌株的鑒定不夠精確，進(jìn)一步研究可通過選擇擴(kuò)增DNA多態(tài)性更為顯著的片段，或許可以對(duì)治療前后菌株復(fù)發(fā)及再感染做出更精確的判斷。PCR-SSCP方法用于治療前后菌株的鑒定，可以從活檢胃粘膜中直接增出DNA片段用于SSCP分析，省卻了細(xì)菌培養(yǎng)的繁瑣耗時(shí)的過程，特別適用于那些治療后細(xì)菌培養(yǎng)無法檢出，而實(shí)際上仍然少量存在的Hp菌株的鑒定，這是其它菌相提并論鑒定方法難以達(dá)到的。研究表明，Hp存在著致病力不同的兩組菌株，它們致病力的不同表現(xiàn)在與不同的病癥的關(guān)系上。Tee等用Southern印跡法對(duì)Hp核糖帶型的研究，未發(fā)現(xiàn)Hp的核糖型或核糖型的某條帶與臨床疾病有對(duì)應(yīng)關(guān)系、Yoshimara等用DNA-DNA雜交技術(shù)證實(shí)，十二指腸潰瘍和無癥狀胃炎病人感染的Hp有明顯的遺傳學(xué)差別。本研究對(duì)不同Hp菌株基因組DNA203bp片段的SSCP分析，未發(fā)現(xiàn)與臨床某一疾病相關(guān)的細(xì)菌DNA單鏈構(gòu)象，可能由于該片段編碼的信息與Hp的致病力無關(guān)，對(duì)Hp毒素相關(guān)基因的分析或許可以發(fā)現(xiàn)與不同疾病表現(xiàn)相關(guān)的菌株，有待今后進(jìn)一步研究。

王蔚虹1 胡伏蓮1 賈博琦1 瞿峰2 朱立煌2

1北京醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院胃腸科（100034)

2中國科學(xué)院遺傳研究所