四、可進行微循環(huán)觀察的動物器官及方法
�。ㄒ�)頭部器官
動物的眼球結(jié)膜、虹膜、眼底、鼻粘膜、口唇、牙齦、舌、鼓膜、耳殼等都可以普通顯微鏡在放大40倍到100倍的條件下進行微循環(huán)觀察。這些部位的動物觀察方法與人的相似。以家兔眼球結(jié)膜觀察方法為例：要選用白色家兔，因其球結(jié)膜色白，微血管精晰可見。不可采用灰色或黑色的家兔，因其球結(jié)膜色深，不易辨別其微血管。將2～2.5kg體重的白毛家兔的在清醒狀態(tài)下側(cè)臥位置于一特制的長方形固定盒內(nèi)，使兩耳及其頭部露出，頭頸部和嘴用兔頭夾和鐵環(huán)加以固定，剪去左側(cè)眼瞼睫毛，以眼科開瞼器將上下眼瞼撐開，暴露出球結(jié)膜血管，然后用高壓水銀聚光燈，以45度斜照于球結(jié)膜上，雙目解剖顯微鏡放大40倍，可直接觀察到球結(jié)膜的微循環(huán)。
�。ǘ�)氣管微循環(huán)觀察法
選用大白鼠或家兔麻醉后，剪去下頜及頸部的毛，消毒皮膚，固定四肢（仰臥)。沿頸正中線自下頜部甚胸骨上緣作垂直切口，剝離軟組織與肌肉，小心不要損傷血管，用兩把紋式止血鉗夾住兩胸鎖乳突肌中部輕輕拉開。于甲狀軟骨環(huán)上輕輕剪斷一對胸骨甲狀肌及其附著的肌膜，將該肌肉放于遠端，便可暴露自甲狀軟骨至第十軟骨環(huán)間區(qū)的氣管，輕輕于解剖鏡下（放大16倍)剔去氣管表面的結(jié)締組織，便可以將光射于放大60倍左右的氣管軟骨上以及軟骨環(huán)間區(qū)的粘膜上觀察微循環(huán)的動態(tài)變化。觀察應(yīng)于恒溫裝置中進行，并在氣管表面滴以恒溫灌流液。
正常大鼠或家兔氣管軟骨環(huán)間區(qū)的微血管較為豐富。細靜脈、細動脈血流方向相反，毛細血管網(wǎng)穿插于細動脈和細靜脈間，而在軟骨環(huán)表面上有極細的毛細管網(wǎng)。微血管內(nèi)血流均勻，流速較快，血管充盈度良好。連續(xù)觀察25～30分鐘不見有明顯改變。氣管炎模型的大鼠氣管微循環(huán)出現(xiàn)明顯變化，變化程度與氣管粘膜病變程度密相關(guān)�；钛鏊幬镒⑷牒螅擅黠@改善大鼠氣管炎微循環(huán)障礙。
�。ㄈ�)肺微循環(huán)觀察方法
一般用家兔、貓、狗或其它大動物進行。動物麻醉后呈右側(cè)臥位固定于動物臺上，凈皮、去左胸部的毛，消毒皮膚。于第三、四肋間作弧形切口，剝離皮膚，沿胸骨邊緣輕輕剪斷胸大肌、胸小肌的附著處，將二肌肉剝向一邊。在三、四肋間沿肋骨邊緣用鈍頭眼科剪和眼科鑷輕輕剔去肋間肌。注意要特別小心，謹防損傷胸膜。只要在胸膜上造成針尖大小的孔，肺便可發(fā)生萎陷。因此，肋間肌要一束一束仔細地剔去。最后可暴露無遺1cm見方的窗，透過透明的胸膜于顯微鏡下觀察肺循環(huán)動態(tài)。此即“胸膜開窗”法。
開窗部位最好在第三、四肋間或第五、六肋間靠中線的地方。此外較薄的肺葉以心包作襯底，易于觀察。由于觀察的是呼吸著的肺，所以觀察者要善于抓住動物的呼吸規(guī)律，選其呼吸空間進行觀察，也可進行照明。
“胸膜開窗”是觀察活體肺微循環(huán)的唯一可行的辦法，因為肺臟一暴露于空氣下便萎縮。如能將染料注入法、同位素注入或熒光示蹤及肺血流量測定法與胸膜開窗活體觀察法配合進行，便可得到更理想的結(jié)果�！靶啬ら_窗”觀察肺微循環(huán)是可以連續(xù)進行的；第一次觀察完畢后，可用一圓形有機玻璃薄片敷于窗上，以縫線固定于周圍肌肉，將胸小肌、胸大肌恢復(fù)原位，縫合皮膚切口，加強護理�？捎诘�2天、第3天、第4天連續(xù)重復(fù)上述步驟，進行反復(fù)觀察。一般在第4、5天，胸膜上便生出一層結(jié)締組織，變?yōu)椴煌该�。此時如有必要可選其它肋間進行再次開窗，手術(shù)應(yīng)在消毒條件下進行。
�。ㄋ�)背斜方肌微循環(huán)觀察法
大鼠背斜方肌很薄，表淺，易于照明，面積寬而長，血管神經(jīng)可保持完整。制備方便而簡單，10～15分鐘可完成全部制備。此外皮膚切口可絲毫不損傷周圍組織，而且不易造成出血。對動物整個機體影響不太大，可進行長時間觀察，而且這個部位易于進行顯微鏡下觀察。因此，背斜方肌對于研究血管活性物質(zhì)和機體對藥物的應(yīng)答反應(yīng)是非常方便和理想的。
背斜方肌又稱脊肩胛肌，是成對的肌肉，它縱伸于背部到腰部，它的肌纖維自第4胸椎至第3腰，并向兩邊伸展至肩胛線，它的神經(jīng)支配來自脊副神經(jīng)和第2、3頸部神經(jīng)。它的供血來自腋動脈的肩胛下支和頸表淺動脈有肌肉分支。它的靜脈注入前頸靜脈。
實驗采用大白鼠或金黃地鼠，體重70～120g，高于120g體重的鼠其背斜方肌過大過厚，不利于照明。用30mg/100g劑量戊巴比妥鈉麻醉。將動物背部去毛、消毒。自頸部至腰部沿脊柱中線作皮膚切口。剝離結(jié)締組織，用小虹膜剪將肌肉筋膜輕輕剝離，在肌肉側(cè)面作一小小切口并用小彎剪輕輕剝開肌肉游離面（沿肩胛線)，將小剪伸向肌肉底部將其完全與底層肌肉剝離。如遇有一兩支小血管可以用4號將線結(jié)扎。這樣便可得到一個寬為1.5cm左右的游離肌肉瓣。觀察時使動物側(cè)臥，將肌肉游離邊用細大頭針固定于特制灌流盒上（與金黃地鼠灌流盒類似)。用含有1％明膠的林格氏液灌流。用NaHCO3將pH調(diào)為7.35，灌流液保持35～37℃。
利用脊斜方肌制備可進行低倍、高倍、水鏡、油鏡觀察。可以進行極漂亮的電影拍攝，可以清晰地分辯粘附于管壁的白血球�？梢赃M行各種藥物作用的研究，尤其適于微電極插入或微傳感器插管進行在體微血管壓力和微血流測定。醫(yī).學(xué) 全在.線提供www.med126.com
�。ㄎ�)頰囊微循環(huán)觀察法
實驗選用敘利亞種金黃地鼠，雄性，體重90～120g，在動物口腔兩側(cè)后角各有一頰囊供貯存食物之用。頰囊組織與皮膚組織相似。是由纖維結(jié)締組織、鱗狀上皮、骨骼肌、疏松結(jié)締組織四層構(gòu)成。頰囊的伸縮性很大，其容量可由1～2ml擴張到5～6ml。頰囊血供豐富，有致密的微血管網(wǎng)，是各種口徑的微血管高度集中之地。頰囊組織薄而嫩，顏色淡，透光性好，微血管清晰，制備簡單，既可作急性實驗，也可作慢性連續(xù)觀察實驗，而且由于它是雙側(cè)對稱器官，有些實驗過程可在同一動物身上進行自身照射。
1．頰囊的簡單制備 實驗時，動物腹腔注以2.5%戊巴比妥鈉30mg/kg體重進行麻醉。然后將口腔打開，沿一側(cè)頰邊輕輕伸進中號鈍頭鑷子，伸到肩部時夾住頰囊盲端，從口中取出內(nèi)面翻于外的盲囊，以滴管用37℃左右的生理鹽水沖凈其上的食物殘渣，將頰囊展平，用彎形大頭針固定于以透明有機玻璃制作的頰囊灌流盒上。啟動恒溫灌流系統(tǒng)并將灌流盒置于顯微鏡下，即可以透射光觀察頰囊上微血管各項指標(biāo)（放大100倍以下)。如觀察需放在100倍以上進行，則需制備單層頰囊。此時頰囊上選擇一個毛細血管網(wǎng)最少的區(qū)域，剪一個小切口。如需大面積觀察則可沿頰囊動脈平行部分作縱長切品，在切口邊緣部尚可作小小橫切（垂直向兩邊)。其后用小虹膜剪在解剖鏡下將疏松結(jié)締組織移去。經(jīng)過這樣制備的頰囊，在顯微鏡下成象更加清晰。
2．頰囊的恒溫灌流 頰囊灌流盒底板形態(tài)如圖10-11所示，是一個24×18cm2的透明有機玻璃板，板上固定以直徑為6cm、高為0.8cm的圓槽，槽中套以直徑為4cm、高為0.4cm的開口雙層環(huán)槽。環(huán)槽中灌以彈性透明硅橡膠，由圓槽一邊底部輸入恒溫灌流液，另一端輸出灌流液。灌流液的pH應(yīng)調(diào)為中性（pH=7.35)并通過氧氣。灌流液的溫度以控溫儀或以恒溫水浴控制在37℃。整個實驗過程中，恒溫灌流液以慢速徐徐通過頰囊表面及底面。
圖10-11 金黃 地鼠頰市灌流裝置
3．頰囊小室制備法
頰囊小室由底板和頂板組成，兩板面積相同（直徑為2～2.5cm)。頂板邊緣有凹槽，中央有圓窗，圓窗粘以極薄的透明有機玻璃或云母片。底板由較薄的透明有機玻璃作成。兩板在相應(yīng)部位各有兩個小孔。底板兩孔處固定兩個有機玻璃的小楔子，可穿進頂板上的兩孔。
動物麻醉后，刮去一側(cè)頰部、頸部及肩部的毛。先將頰囊從口內(nèi)取出，以生理鹽水沖洗凈并放回。之后將小室底板用鑷子輕輕塞入左側(cè)頰囊，盡可能送到頰囊盲端。使動物右側(cè)臥、固定。消毒皮膚，透過皮膚可觸到入在頰囊中的底板的兩楔，用消毒手術(shù)器械在兩楔間皮膚作一小切口，并小心擴展切口到底板直徑長。剝離結(jié)締組織，使覆蓋有頰囊膜的底板完全暴露于解剖鏡下，用虹膜剪將膜上疏松結(jié)締組織清除。注射不能損傷血管。為防止組織過干或發(fā)生血瘀，上述步驟要盡速進行。
上述步驟完畢后，于底板頰囊上滴以生理鹽水，將1mm2的腫瘤組織塊輕輕入于頰囊膜中央，迅速將頂板的兩孔穿進底板兩楔、蓋緊（防止氣泡進入)，然后于每一楔孔滴以有機粘合劑，此時，于兩板間形成一個小室，在此小室中腫瘤組織可生長。將皮膚切口邊緣先以普通縫線穿一圈，再緊緊扎入頂板側(cè)槽。于小室周圍敷以胺黃粉。小室制備即完成。為防止感染，給動物每日肌內(nèi)注射2500單位的多粘菌素B，3～4天。
利用頰囊小室法可進行多種惡性腫瘤移植的研究，如乳腺癌、黑色素瘤、血管周期細胞瘤、神經(jīng)鞘瘤等，并可于瘤組織植入后任何時間透過小室以顯微鏡觀察瘤組織周圍血管再生及發(fā)育情況和特點。
�。�)縫匠肌微循環(huán)觀察法
實驗選用貓。貓的縫匠肌是一種可以用于進行離體實驗或在體透明實驗的最好的肌肉。可以用以進行正常微血流、微血壓、充血、出血以及胃骼肌微血流調(diào)節(jié)的研究。
縫匠肌是大腿內(nèi)側(cè)表淺肌肉，它起于髂前上棘，終于脛骨近端和髕骨。其內(nèi)緣之下正是股動脈和股靜脈，有9cm長，4cm寬，由它可取得平均5g重的離體肌肉。
縫匠肌的供血由側(cè)旋股動脈及股動脈分支而來，其遠端尚有下行膝動脈供血。
實驗時，動物以75mg/kg體重劑量的α-氯醛醣靜脈注射麻醉。動物側(cè)臥位固定，將其一腿（下部的)伸展。凈皮，去毛并消毒，沿大隱靜脈走向自腹股溝下1cm處至膝內(nèi)側(cè)作皮膚切口，輕輕剝離皮膚。其后，于大腿內(nèi)緣與該切口相平行作另一切口。盡可能將皮膚剝離以暴露更大面積的肌內(nèi)。露暴軟組織以恒溫灌流液浸透的紗布濕敷。在將縫匠肌中間部位的筋膜、結(jié)締組織剝離完全后，便可以用冷光束照明裝置伸于縫匠肌正中底部，并于顯微鏡下觀察該肌肉上的微血流和進行各種測定。
如要取得離體縫匠肌，需在上述步驟之后先將縫匠肌周圍小血管一一結(jié)扎，只留下由大隱靜脈和股動脈、股靜脈而來的主要分支。此后，進行股動脈分支與股靜脈分支插管（一支輸入，一支輸出)待插管圓滿完成后將其它所有血管結(jié)扎（包括大隱靜脈來的所有血管)。然后將肌肉兩端以特制的小夾子夾住。從夾子外緣剪下，離體的肌肉掛在一個鋁制支架上置于恒溫，恒溫裝置可于顯微鏡下進行各種灌流實驗。一塊6g重的肌肉，其血液灌流量通常0.2～0.3ml/分。好的肌肉制備可連續(xù)維持6小時以上的實驗。
（七)腸系膜、大網(wǎng)膜、腸壁微循環(huán)觀察法
遠在200年前就有人將腸系統(tǒng)、大網(wǎng)膜的微循環(huán)進行了顯微鏡觀察。因為它最易取出，并且血管清晰。小鼠、大鼠、豚鼠、田鼠、家兔、貓、狗等動物的腸系膜和大網(wǎng)膜及腸壁皆可用于微循環(huán)觀察，并且無明顯差別，所用動物不宜過老，否則脂肪過多影響觀察。Zweifach認為：回盲部腸系膜是最好的微循環(huán)觀察區(qū)。因為它具有區(qū)域小而局限、沒有腸蠕動、取出時不易損傷、脂肪組織少等優(yōu)點。
實驗時，動物麻醉同前。消毒腹部一側(cè)皮膚，剪一個1～2寸的切口。動物側(cè)臥于灌流盒邊。取出欲觀察的腸系膜或大網(wǎng)膜部位，輕輕伸展于透明有機玻璃制成的灌流盒上進行恒溫灌流；灌流時流與滴相結(jié)合，灌流液用磷酸緩沖液調(diào)至pH7.2～7.35。灌流液中亦可加入白蛋白，使其成為1%白蛋白液。灌流液原瓶中通以O(shè)2和5%CO2。
在進行腸系膜微循環(huán)觀察時，要特別注意維持動物體溫恒定。因為過冷或過熱都要引起不正常的腸蠕動，影響實驗效果。為此，必須監(jiān)測動物肛溫或口溫。連續(xù)記錄體溫曲線。動物最好躺在電熱墊上并蓋以小被維持恒定的正常體溫。一般說來，一切條件保持得好，可連續(xù)進行兩小時以上的正常實驗，也可能5～6小時都保持平衡，應(yīng)該停止實驗的早期信號是：腸系膜上收集靜脈中出現(xiàn)白細胞附壁粘著現(xiàn)象；其后是紅血球滲出。因之，如不維持嚴格的恒溫灌流和保持恒定的體溫，所進行腸系膜的微循環(huán)動態(tài)記錄肯定是不客觀的。醫(yī)學(xué)全在.線提供
家兔腸系膜微循環(huán)觀察時，以烏拉坦或戊巴妥納靜脈注射麻醉后，背住縛于兔板上（有加溫裝置)，剪去腹部之毛，沿腹中線作一長6～8cm的切口進入腹腔。將上腹腔臟器推向右側(cè)，于腹腔左上方找到回盲交界處（回腸為淺紅色，結(jié)腸為灰色)在該部位上的上段輕輕拉回腸袢約10cm，將該段腸管及系膜通過有機玻璃流盒的后側(cè)壁凹槽和褲形裝（見圖10-12)，然后浸入充滿38℃灌流液的小盒中，并輕輕把腸系膜平鋪在灌流盒的中央圓合上，用大頭針將腸系膜固定于中央圓臺內(nèi)側(cè)邊的軟木片上。將腹壁、漿膜層和肌層縫合，并把切口右緣皮膚縫合固定于灌流盒側(cè)壁的鎖眼處。
圖10-12 檢查家兔腸系膜微循環(huán)灌流盒
灌流盒右側(cè)壁有一進水管與盛滿任一臺氏營養(yǎng)液的恒溫壓灌流瓶相連接，使?fàn)I養(yǎng)液不斷地流經(jīng)小盒而自左側(cè)壁的出水管口流出。以80W高壓水銀燈的光束投照平鋪在中央圓臺上的腹系膜上，雙目顯微鏡放大40～80倍，可進行腸系膜血管口徑、血流速度和血流狀態(tài)觀察。為了防止造成腸系膜的局部血流障礙和游斑性出血，要避免過分牽拉或摩擦腸系膜，要不斷向腸系膜上滴加溫?zé)岬纳睇}水，避免干燥刺激。
（八)提睪丸微循環(huán)觀察法
實驗采用雄性大白鼠，體重80～110g，小于80g的大鼠提睪肌太小不利于制備，大于110g的大鼠太老，結(jié)締組織增生，不利于觀察。以25mg/kg體重劑量的戊巴比妥納麻醉大鼠，或以130mg/100體重劑重的烏拉坦肌注（經(jīng)常注入股田頭肌)。將手術(shù)區(qū)域剃毛、洗凈、消毒，最好進行氣管切開，插管以保證呼吸順利。進行股動脈插管測動脈壓或準備靜注藥物。手術(shù)器械進行消毒。手術(shù)時，先用針在手術(shù)側(cè)陰囊遠端穿以縫線，將縫線固定在動物固定板的小釘上。然后在陰囊上作縱切口，切開皮膚、筋膜，輕輕剝離。將切口慢慢延長到離腹溝5～8mm處。用膠體林格氏液（pH7.35)開始輕輕灌流，于剝離的軟組織上敷一層灌脫脂棉絮，棉絮浸以灌流液。將皮膚切口之每邊穿兩根絲線固定于動物板上。如圖10-12所示，繼續(xù)游離提睪肌，使之脫腦周圍組織。將提睪肌輕輕作縱向切開并將其輕輕與睪丸剝離。用兩個外科結(jié)扎連接睪丸和提睪肌的小血管，從兩結(jié)中間剪斷。如圖10-13所示沿副睪縱柚將附睪系膜剪開。將睪丸和附睪經(jīng)腹股溝環(huán)輕輕送入腹腔。提睪肌周圍等距穿進5～6根絲線。動物仰臥，將提睪肌展鋪于特制的馬蹄形透明有機玻璃柱上，柱周圍有等距的5～6個小缽，可將絲線結(jié)于釘上固定提睪肌。透明柱可調(diào)高低，其周圍為恒溫灌流盒（與金黃地鼠頰囊灌流裝置相似)。
圖10-13 分離提睪肌方法
提睪肌極薄，其上有各種口徑的微血管，成像清晰，適于進行各種微循環(huán)參數(shù)測定，尤其獨特的是提睪肌上最微細的毛細血管網(wǎng)也特別清楚，適于進行管腔、管壁動態(tài)變化和微血管與組織間物質(zhì)交換的研究。也可用染料或熒光示蹤劑進行淋巴微循環(huán)的研究。
