三、分離
目的微生物不純，需分離純化。采用簡便迅速，有一定準確性的檢出方法，提高篩選效率。常用平皿反應法：
紙片培養(yǎng)顯色法：浸有指示劑濾紙。
透明圈法：混濁底物被分解后形成透明圈。如可溶性淀粉、碳酸鈣等。
變色圈法：直接用顯色劑或指示劑。
生長圈法：利用某些具有特殊營養(yǎng)要求的微生物作為工具菌，要分離的微生物能在一般培養(yǎng)條件下生長而合成該營養(yǎng)物而使工具菌能生長，形成生長圈。
抑制圈法：瓊脂塊培養(yǎng)法。
四、篩選
即進行生產(chǎn)性能測定，確定適合生產(chǎn)要求菌種。
一般初篩、復篩、再復篩，少數(shù)幾株進行全面考察。
篩選時培養(yǎng)條件確定是關鍵，培養(yǎng)基組成、通風、pH、溫度等應根據(jù)菌株性能、產(chǎn)物代謝途徑、類似產(chǎn)品的培養(yǎng)條件及前人的工作進行綜合考察，慎重選定。
初篩一株一瓶，取其中10-20%復篩，一株3瓶，直至最后3-5株，廣泛考察。
（二)自發(fā)突變與育種
一、生產(chǎn)育種
二、定向育種
用某一特定環(huán)境長期處理某一微生物群體，同時不斷地進行移種傳代，以達到積累和選擇合適的自發(fā)突變體的一種古老育種方法。
近年發(fā)展代謝類似物的梯度培養(yǎng)皿法。
（三)誘變育種
利用物理或化學誘變劑處理均勻分散的微生物細胞群，促進其突變率大幅度提高，然后設法采用簡便、快速、高效的篩選方法，從中挑選少數(shù)符合目的的突變株，以供生產(chǎn)科研之用。
基本工作步驟：
基本步驟
原種 （出發(fā)菌株) → 純化→斜面→同步培養(yǎng)→離心洗滌→振蕩打散→過濾→菌懸液
→誘變處理 → 平板分離 → 斜面 → 斜面→ 斜面 →保藏及擴大試驗
（活菌計數(shù)) （計數(shù)) （變異率)（初篩) （復篩) （再復篩)
一、出發(fā)菌株的選擇
用作出發(fā)菌株有：野生型菌株；生產(chǎn)菌株；經(jīng)過誘變的菌株。
一般要求生長快，營養(yǎng)要求粗放，發(fā)育早，產(chǎn)孢子多，對誘變劑敏感性高，已能積累少量產(chǎn)品或前體物的菌株。
二、菌懸液制備
一般采用單孢子或單細胞懸液。
誘變劑一般只作用與DNA的一條鏈，發(fā)生變異無法反映在當代表型上，只有經(jīng)過DNA復制和細胞分裂后，才會使表型發(fā)生變異，此即表型延遲。
制備菌懸液時要注意生理狀態(tài)、均一性、細胞濃度、菌懸液介質(zhì)（生理鹽水或緩沖液)。
三、誘變處理
1、常用誘變劑：
物理誘變劑：紫外線（UV)、X射線、r射線、快中子（0.2-10Mev)。
化學誘變劑：硫酸二乙酯DES，甲基磺酸乙酯EMS，亞硝基胍NTG。
總結表
2、誘變劑量：
誘變劑作用：提高突變率；擴大產(chǎn)量變異幅度；使變異朝正變或負變方向移動。
凡是在高誘變率基礎上，既能擴大變異幅度，又能使變異移向正變范圍的劑量就是合適劑量。圖8-21
3、處理方法：
采用復合處理，包括誘變劑先后使用，同時使用和重復使用，提高效果。
表8-8
四、變異菌株的分離和篩選
誘變處理后一般要經(jīng)過后培養(yǎng)和變異株篩選。
一般將篩選分為初篩和復篩。
初篩重點在于分離培養(yǎng)盡可能多菌株，采用預先設計的相同培養(yǎng)條件，以量為主，準確性其次，減少漏篩機會。
復篩以質(zhì)為主，反復多次。
高效篩選方案：
尋找利用和創(chuàng)造形態(tài)、生理與生產(chǎn)性狀間的相關性。
篩選抗生素生產(chǎn)菌時，可采用瓊脂塊培養(yǎng)法：圖8-22
（四)營養(yǎng)缺陷型篩選
基本培養(yǎng)基（MM，[—])：凡能滿足某一菌種野生型和原養(yǎng)型菌株營養(yǎng)要求的最低成分的組合培養(yǎng)基。
完全培養(yǎng)基（CM，[+])：在基本培養(yǎng)基中加入一些富含生長因子的物質(zhì)，以滿足該微生物各種營養(yǎng)缺陷型要求。
補充培養(yǎng)基（SM，[X])：在基本培養(yǎng)基中有針對性地加上某一種或幾種其自身不能合成的成分，以滿足相應營養(yǎng)缺陷型生長的培養(yǎng)基。
營養(yǎng)缺陷型表示：所要求的營養(yǎng)物的頭三個字母表示，如bio-，對應的野生型以bio+表示。
一般步驟：
1、誘變處理
2、淘汰野生型：抗生素法、菌絲過濾法。
3、檢出缺陷型：方法有
1)夾層培養(yǎng)法：圖8-23。
2)限量補充培養(yǎng)法：含微量蛋白胨（0.01%)的[一]上。
3)逐個檢出法：分別接種到[—]和[+]上。
4)影印接種法：[+]培養(yǎng)，影印至[—]上。
4、鑒定缺陷型：
1)生長譜法：缺陷型斜面培養(yǎng)后，制成菌懸液涂布于[—]上，平板上劃成不同區(qū)域，分別加上一種所需測驗的營養(yǎng)物，培養(yǎng)觀察。
2)組合補充培養(yǎng)基法：菌株較多時用。
營養(yǎng)缺陷型應用
1、標記菌種：代謝途徑、雜交、基因重組中。
2、生物測定用菌
3、生產(chǎn)菌株：前體積累。
（五)抗性突變株篩選
1、一次性篩選：在對于出發(fā)菌株完全致死的環(huán)境中一次性篩選少數(shù)抗性突變株。
2、階梯性篩選：使用濃度梯度與某一空間或時間。
空間—梯度培養(yǎng)皿法：圖8-18。
時間—類似于馴化。
4節(jié):基因重組與雜交育種
雜交hybridization：兩個性狀不同的菌株或變種之間進行細胞結合，遺傳物質(zhì)交換重新組合成新的性狀。
基因重組gene recombination：兩個不同性狀個體內(nèi)的遺傳基因轉移到一起，經(jīng)過遺傳分子的重新組合后，形成新遺傳型個體的方式。
二者關系
一、原核微生物的基因重組
（一)轉化 transformation
概念：受體菌直接吸收了來自供體菌的DNA片段，通過交換，把它組合到自己的基因組中，從而獲得供體菌部分遺傳性狀的現(xiàn)象。
轉化后的受體菌，稱轉化子transformant
DNA—轉化因子。
條件：
1、能進行轉化的細胞必須是感受態(tài)的。即受體菌最易接收外源DNA片段并實現(xiàn)轉化的生理狀態(tài)。
2、DNA一般都是線狀雙鏈DNA，不小于5×105D，轉化的片段小于107D，平均含15個基因。
轉化頻率較低，一般0.1~1%。
過程：圖8-25
雙鏈DNA結合→酶促分解、形成片段→一條單鏈降解，一條進入→同源配對、受體相應段切除，交換，雜種DNA→復制、分離、轉化子。
圖8-26
轉化育種：DNA提取，感受態(tài)細胞培養(yǎng)和轉化。
轉染：把噬菌體或其他病毒DNA（RNA)提取出來，用它去感染感受態(tài)的宿主細胞，并產(chǎn)生正常噬菌體或病毒后代。
（二)轉導transduction
概念：通過缺陷噬菌體的媒介，把供體細胞的DNA片段攜帶到受體細胞中，從而使后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象。
U型管實驗：兩株營養(yǎng)缺陷型LA-22（try-)，溶源性細菌（受體)；LA-2（his-)，敏感菌（供體)；溫和性噬菌體P22。結果在LA-22端出現(xiàn)原養(yǎng)型his+try+。原因？
1、普遍轉導
噬菌體可誤包裹供體菌中任何基因（包括染色體外遺傳物質(zhì))，并使受體菌實現(xiàn)各種性狀的轉導。
1)完全普遍轉導：
噬菌體誤包入供體菌DNA片段，形成完全不含本身DNA的假噬菌體（一種完全缺陷噬菌體)，感染受體菌后，受體不會溶源化，也不會裂解。導入的DNA片段與同源區(qū)配對，通過兩次交換而重組到受體菌DNA上，形成穩(wěn)定轉導子。
2)流產(chǎn)普遍轉導
在獲得供體菌DNA片段的受體菌內(nèi)，如果轉導的DNA不能進行重組和復制，其上的基因僅經(jīng)過轉錄而得到表達。
此外源DNA能夠保持下去，任何時候只有一個細胞含有它。表型上仍 出現(xiàn)供體菌特征，能在選擇性培養(yǎng)基上形成微小菌落。
2、局限轉導
通過某些部分缺陷的溫和噬菌體把供體菌的少數(shù)特定基因轉移到受體菌中的轉導現(xiàn)象。
產(chǎn)生機制：不正常切割 圖8-30
溫和噬菌體整合到細菌DNA特定位點上，誘導裂解時，在插入位點兩側的少數(shù)宿主基因會因偶爾發(fā)生的不正常切割而連在噬菌體DNA上，一起包入噬菌體中，形成部分缺陷噬菌體，無正常噬菌體的溶源性和增殖能力。
Compbell模型
（1)低頻轉導（LFT)
E. dgal) 頻率為10-4--10-6 ，稱低頻轉導。LFT 裂解物在低moil phage 成熟時，產(chǎn)生轉導噬菌體（ lcoli k12的 下感染宿主，可得極少量局限轉導子。
缺陷噬菌體。l dgal— 帶有半乳糖基因的l
（2)高頻轉導（HFT)
E. coli 。l dgal 的 細胞，幾乎同時感染有正常lgal-受體菌用高moi的LFT裂解物進行感染時，則凡感染有
兩種噬菌體可同時整合到受體菌DNA dgal。l 和l dgal 所 缺失基因功能，兩個噬菌體同時復制，產(chǎn)生裂解物中，大體上含等量l 可補償l上，使其成為雙重溶源菌 ，誘導裂解時，正常 用低moi 的HFT 裂解物感染宿主，可高頻率轉導。
3、溶源轉變 lysogenic conversion
當溫和噬菌體感染其宿主而使之發(fā)生溶源化時，因噬菌體基因整合到宿主基因上，而使后者獲得了除免疫性以外新性狀的現(xiàn)象，稱溶源轉變。
與轉導本質(zhì)上不同，噬菌體不攜帶任何供體菌基因，是完整的，而非缺陷的。
普遍轉導與局限轉導比較(插入)
（三)接合conjugation
概念：通過供體菌和受體菌完整細胞間的直接接觸而傳遞大段DNA的過程。也稱雜交。
基本原理：
細菌、放線菌中都存在接合現(xiàn)象。放線菌中天藍色鏈霉菌( Streptomyces coelicolor)研究的最為詳細。細菌中，大腸桿菌研究最清楚。
F+ + F- = F+
F因子傳遞過程—滾環(huán)模型：
Hfr + F- = F-
與F-接合時， Hfr染色體在F因子處發(fā)生斷裂，環(huán)狀變成線狀，轉移至 F- 約100分鐘，F(xiàn)因子最后轉移。轉移過程中經(jīng)常會發(fā)生斷裂，所以重組頻率高，但很少出現(xiàn)F+ 。
轉移過程與F因子傳遞過程基本相同，但進入F- 的單鏈DNA經(jīng)雙鏈化后，形成部分合子，然后同源配對，經(jīng)過兩次或以上的交換才能發(fā)生重組。
中斷雜交實驗
Hfr染色體轉移有嚴格的順序性，實驗中可每隔一定時間利用強烈攪拌等措施，中斷接合，從而獲得呈現(xiàn)不同數(shù)量Hfr性狀的F- 接合子。
根據(jù)在F- 中出現(xiàn)Hfr各種性狀的時間早晚，可以畫出一幅較完整的環(huán)狀染色體圖。
F` 菌株—Hfr菌株的F因子因不正常切割而脫離染色體時，可形成游離的但帶有一小段染色體基因的F因子，稱為F`因子。
此帶有F`因子的菌株—初生F`菌株。
初生F`+ F- =F`（次生F`菌株)
既獲得了F因子，又獲得了來自初生F`菌株的若干遺傳性狀，以這種接合來傳遞供體菌基因的方式，稱F因子轉導。（F—duction)
次生F`菌株中，一部分F因子可重新整合到染色體上，恢復成Hfr菌株。
接合育種
育種前所選擇的親本必須具有一定的選擇性標記，還必須具有F因子，受體菌無F因子，但必須為F因子可親和。
1、菌株準備
2、雜交
3、重組體檢出
（四)原生質(zhì)體融合 Protoplast Fusion
通過人為方法，使遺傳性狀不同的兩細胞的原生質(zhì)體發(fā)生融合，并產(chǎn)生重組子的過程，又稱細胞融合。
