一、特點
1、雜交頻率高
2、受接合型或致育性限制較少，但與親緣性有一定關系。
3、遺傳物質(zhì)傳遞更完整。
4、存在兩株以上親株同時參與融合可能。
5、可以采用產(chǎn)量性狀較高菌株作融合親株。
6、提高生產(chǎn)性狀的潛力較大。醫(yī)學全在線友情提供med126.com
7、原生質(zhì)體較容易進行轉(zhuǎn)化，可用于工業(yè)微生物育種工作
二、主要步驟
1、原生質(zhì)體制備：
作為育種菌株須：①具有良好生產(chǎn)性狀②具有一些穩(wěn)定的明顯的遺傳標記。
一般采用雙標記，避免回復突變干擾。離心收集對數(shù)后期菌體，破壁。原生質(zhì)體低滲中易破裂，使用滲透壓穩(wěn)定劑進行保護。（甘露醇、山梨醇、蔗糖、氯化鉀、氯化鈉等)
離心收集原生質(zhì)體。
2、原生質(zhì)體融合：
加入促融合劑—聚乙二醇（PEG)及Ca2+、Mg2+，使原生質(zhì)體表面形成電極性，相互易于吸引，形成聚集物。UV、電場、激光等技術(shù)可應用。
3、再生成正常細胞：
融合后的原生質(zhì)體不具細胞壁，不能在普通培養(yǎng)基上增殖，無法表現(xiàn)，必須使其重新形成壁。再生培養(yǎng)基必須具有與原生質(zhì)體體內(nèi)相同滲透壓，常用含Ca2+、Mg2+及滲透壓穩(wěn)定劑的完全培養(yǎng)基。
檢出融合細胞。
外源基因命運
1、具備復制的必要因子，能在受體細胞中堅持下去并進行復制，發(fā)展成部分二倍體無性系。
2、流產(chǎn)轉(zhuǎn)導。
3、被酶解—寄主限制。
4、重組。
二、真核微生物基因重組
（一)有性雜交
一般指性細胞間的接合和隨之發(fā)生染色體重組，并產(chǎn)生新遺傳型后代的一種方式。
常見有性孢子。
（二)準性生殖parasexual reproduction
類似于有性生殖但更為原始的一種生殖方式。可使同一生物的兩個不同來源的體細胞經(jīng)融合后，不通過減數(shù)分裂而導致低頻率的基因重組。
主要過程：圖8-37
1、菌絲聯(lián)結(jié)、質(zhì)配。
2、形成異核體。
3、核配。
4、體細胞交換和單倍體化。
體細胞中染色體交換—有絲分裂交換：雙倍體雜合子遺傳性狀不穩(wěn)定，進行有絲分裂過程中，極少數(shù)核中染色體會發(fā)生交換和單倍體化，而形成具有新性狀的單倍體雜合子。
有性生殖與準性生殖區(qū)別：表8-12
準性雜交
主要步驟：圖8-38
1、選擇親本：要有選擇性標記。
2、強制形成異核體。
3、移單菌落。
4、檢驗穩(wěn)定性。
5、促進變異。然后篩選。
歸納總結(jié)：表8-10
基因工程 gene engineering
5節(jié)：菌種衰退、復壯和保藏
一、衰退與復壯
對產(chǎn)量性狀而言，菌種的負變就是衰退，其他原有典型性狀變得不典型了，也是衰退。
一個重要原因是基因突變，與控制生產(chǎn)性狀有關的基因負變造成生產(chǎn)性狀劣化。培養(yǎng)、保藏條件等也有影響。
（一)衰退的防止
1、控制傳代次數(shù)；
2、創(chuàng)造適宜的培養(yǎng)條件；
3、利用不同類型細胞進行接種傳代；
4、采用有效的菌種保藏方法，加強菌種管理措施。
（二)復壯
1、純種分離
2、通過宿主體進行復壯（寄生性微生物)
3、淘汰已退化個體
二、菌種保藏
首先挑選典型優(yōu)良純種，其次創(chuàng)造一個有利于休眠的環(huán)境條件，還要考慮方法的通用性與簡便性。
1、低溫保藏：冰箱、超低溫。
2、干燥保藏：土壤、細砂、硅膠等。
3、隔絕空氣保藏：石蠟油封。
4、凍干保藏：綜合低溫、干燥、真空。
5、活體保藏：病原微生物、病毒。
實驗室常用方法：
菌種保藏機構(gòu)簡介
中國微生物菌種保藏管理委員會CCCCM
1、普通微生物菌種保藏管理中心
中科院北微所（AS)：真菌、細菌
武漢病毒所（AS-IV)：病毒
2、農(nóng)業(yè)微生物菌種
農(nóng)科院土肥所（ISF)
3、工業(yè)微生物菌種
食品發(fā)酵所（IFFI)
4、醫(yī)學微生物菌種
醫(yī)科院皮研所（ID)：真菌
衛(wèi)生部檢定所（NICPBP)：細菌
醫(yī)科院病毒所（IV)：病毒
5、抗生素菌種
醫(yī)科院醫(yī)藥生物技術(shù)所（IA)
四川抗研所（SIA)：新抗菌種
華藥抗研所（IANP)：生產(chǎn)菌種
6、獸醫(yī)微生物菌種
農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)藥品監(jiān)察所（CIVBP)
中國典型培養(yǎng)物收藏中心（武漢大學)
國外
美國典型菌種收藏所（ATCC)
美國農(nóng)業(yè)部北方地區(qū)研究室（NRRL)
日本大阪發(fā)酵研究所（IFO)
荷蘭真菌中心收藏所（CBS)
法國里昂巴斯德研究所（IPL)
西德柯赫研究所（RKI)
蘇聯(lián)科學院微生物研究所（IM)
六章：微生物生態(tài)與環(huán)境保護
（自然條件下的微生物)
生物圈 biosphere ：地球上有生命活動的范圍，是地球上全部生活有機體與其環(huán)境相互作用的統(tǒng)一整體。是所有生態(tài)系統(tǒng)的總和。
微生物生態(tài)：研究處于環(huán)境之中的微生物，和與微生物相聯(lián)系的物理、化學和生物等環(huán)境條件，以及它們之間的關系。
生態(tài)系 ecosystem ：生物與其生境通過能量流動和物質(zhì)循環(huán)所組成的一個整體結(jié)構(gòu)。生物群落是核心。
1節(jié)：自然界中的微生物
一、土壤中微生物
土壤是自然界最適宜微生物生長的環(huán)境，具有微生物所需一切營養(yǎng)物及各種條件。種類主要是異養(yǎng)型種類。
二、水中微生物
種類和數(shù)量要比土壤中少得多。
淡水中微生物主要來源于土壤、空氣、污水或死亡腐敗的動植物體。海水中微生物總量超過陸地。
飲用水標準：每ml水細菌總數(shù)不超過100個，E. coli每升水不超過3個。
三、空氣中微生物
空氣非微生物生長良好環(huán)境。微生物通過各種方式傳入空氣，又隨風傳播。
數(shù)量取決于環(huán)境。
潮濕空氣中微生物比干燥空氣中少，因為潮濕空氣中微生物被小水滴帶著沉降下去了。
空氣中菌數(shù)測定：過濾收集，培養(yǎng)計數(shù)。
四、極端環(huán)境微生物
了解這些微生物，可以利用其特殊基因、機能，創(chuàng)造有用新種。
2節(jié)：微生物間以及與其他生物間的關系
生物間關系：
一、微生物間關系
1、互生：較松散聯(lián)合，可以是一方得利，或雙方有利。（混菌培養(yǎng))
2、共生：緊密結(jié)合在一起，高度發(fā)展時，形成特殊共住體，生理上有分工，組織、形態(tài)上產(chǎn)生新結(jié)構(gòu)。
地衣：藻類 + 真菌
3、寄生：一種生物生活在另一種生物表面或體內(nèi)，從后者獲得營養(yǎng)。
4、拮抗：一種生物產(chǎn)生不利于另一種生物生存的代謝物質(zhì)或改變環(huán)境條件，抑制甚至殺死另一種生物的現(xiàn)象。
5、捕食：一種生物直接吞食另一種生物。
二、與高等植物關系
共生：根瘤菌，菌根菌
互生：根際微生物
寄生：植物病原微生物
三、與人及動物關系
共生：瘤胃微生物，白蟻
互生：人體腸道正常菌群
寄生：病原微生物，寄生于昆蟲（生物殺蟲劑)
擇生生物（悉生生物)：接種有一種或多種已知微生物的無菌動物。
3節(jié)：微生物與自然界中的物質(zhì)循環(huán)
物質(zhì)循環(huán)：一切生物將所需重要化學元素自非生命物質(zhì)狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩奈镔|(zhì)狀態(tài)，再自有生命的物質(zhì)狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榉巧奈镔|(zhì)狀態(tài)，如此循環(huán)不已。
微生物既是分解者、消耗者，又是生產(chǎn)者。
一、碳素循環(huán)
微生物作用：1)光和作用 2)分解作用
大氣二氧化碳（0.02%)約6000億噸，植物光合作用年消耗600到700億噸，燃燒年產(chǎn)生50～60億噸，人和動物呼吸產(chǎn)生的二氧化碳僅夠植物光合作用一個月之需，90%二氧化碳由微生物代謝活動產(chǎn)生。
經(jīng)光合作用固定地二氧化碳，大部分以聚糖形式累積在木本、草本內(nèi)。
二、氮素循環(huán)
分子態(tài)氮、有機態(tài)氮、無機態(tài)氮
圖9-6。微生物作用：固氮、硝化、反硝化、氨化、氨同化
三、硫素循環(huán)
元素態(tài)、無機化合態(tài)、有機態(tài)
圖9-7。微生物作用：脫硫、硫酸鹽還原作用（同化性、異化性)、硫化（無機硫氧化)。
四、磷素循環(huán)
自然界無機磷主要是磷酸鈣，有機磷主要是核蛋白、核酸、卵磷脂等，都是非溶性的。
轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄�，主要是微生物作用�?BR>4節(jié)：微生物與環(huán)境保護
當有害物質(zhì)濃度超過了生態(tài)系統(tǒng)的凈化能力時，就會造成對生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和機能的破壞，打破生態(tài)系統(tǒng)的平衡，使人類生活的環(huán)境發(fā)生變化，此即環(huán)境污染。
一、微生物對污染物的降解與轉(zhuǎn)化
1、主要污染物
無毒有機物:易被生物降解;
有毒有機物:不易被生物降解。
無毒無機物:一些營養(yǎng)性無機鹽;
有毒無機物:重金屬等Hg As Pb Cd。
2、微生物的降解與轉(zhuǎn)化
對無機污染物的轉(zhuǎn)化
微生物不能降解重金屬，只能使它們發(fā)生形態(tài)之間的相互轉(zhuǎn)化及分散和富集過程。也就是改變金屬在環(huán)境中的存在轉(zhuǎn)態(tài)，從而改變它們的毒性
有機Hg Pb 無機Hg Pb
對有機污染物的降解
農(nóng)藥：主要通過催化作用使農(nóng)藥分子發(fā)生一些結(jié)構(gòu)改變，使其被分解。
石油：多種烴類混合物，多種微生物共同作用，
二、水污染及防治
1、水的污染源
污染指標：
COD（化學需氧量)：使用強氧化劑（高錳酸鉀、重鉻酸鉀)使1L污水中的有機物進行化學氧化時所消耗的氧的毫克數(shù)。mg/L
BOD5(五日生化需氧量)：20℃時，每L廢水所含有機物在5天內(nèi)進行微生物氧化時所消耗的氧量，mg/L。
2、處理廢水的微生物法
(1) 厭氧處理法（產(chǎn)能型)
采用厭氧消化器把微生物可降解的有機物轉(zhuǎn)化成甲烷、二氧化碳、水和其它氣體的一種處理方法。
過程：三個階段，圖9-11:涉及到的微生物，發(fā)生的反應。
(2) 好氧處理法
過程
①活性污泥法（曝氣法)（耗能型)：利用含有好氧微生物的活性污泥，在通氣條件下，使污水凈化的生物學方法。
活性污泥是一種絮狀污泥，主要是菌膠團形成菌，原生動物，有機和無機膠體以及懸浮物組成。人工培養(yǎng)、馴化獲得。
根據(jù)污水在系統(tǒng)中流動狀況分為推流式和完全混合式。
②生物膜法：以好氧微生物組成的生物膜為凈化主體的生物處理方法。
A、滴濾池法（節(jié)能型)（灑水濾床法)
B、生物轉(zhuǎn)盤法（耗能型)
③氧化塘法（節(jié)能型)（穩(wěn)定塘)：大面積敞開式污水處理池，利用藻菌互生系統(tǒng)來分解有機物，使污水得以凈化。
固體廢物采用堆肥法和沼氣發(fā)酵法。
七章：傳染與免疫
1節(jié)：傳染 infection
非傳染性：生理性、遺傳性等
疾病 病原微生物（病毒、細菌)
傳染性
其它生物（寄生蟲等)
傳染是病原微生物侵入機體后，在機體一定部位生長繁殖，并引起一系列病理生理的過程。
傳染是宿主、病原菌、環(huán)境因素三方面力量作用的結(jié)果。
一、傳染的三種可能結(jié)局
1、隱性傳染
2、帶菌狀態(tài)
3、顯性傳染
傳染病專指顯性傳染。
二、決定傳染結(jié)局的三個因素
（一)病原微生物在傳染免疫中作用
要造成感染，必須能抵抗機體內(nèi)的天然防御機能而不被消滅，并在侵入體內(nèi)后能生長繁殖，擾亂機體的新陳代謝，造成傳染。
要具備一些條件才能傳染（P320)
1、毒力或致病性
某種微生物對一定宿主，在一定條件下引起疾病的能力。
強弱取決于以下因素：
1)侵襲力：與酶（卵磷脂酶、透明質(zhì)酸酶、膠原酶、鏈激酶、凝固酶)和微生物結(jié)構(gòu)（莢膜、菌毛、表面抗原)有關。
2)毒素
①內(nèi)毒素：多由G-產(chǎn)生，化學組成為脂多糖。
②外毒素：某些G+分泌到體外的毒性物質(zhì)，化學組成為蛋白質(zhì)。如破傷風毒素、肉毒毒素、白喉外毒素等。
外毒素可用0.3-0.4%甲醛脫毒，成為類毒素（仍保持抗原性)。
內(nèi)、外毒素比較：P322，表10-1
2、數(shù)量
與毒力強弱有關。多數(shù)病原微生物需要足夠數(shù)量侵入機體，才能發(fā)病。
3、侵入途徑
不同菌侵入途徑不同，只有侵入易感機體的一定部位，才能發(fā)病。
（二)機體在傳染免疫中作用（宿主的免疫力)
1、免疫定義 Immune
機體對體內(nèi)外生物性刺激的反應，在正常情況下機體識別異物、排除異物、消滅異物的生理功能。
或者說機體識別自己、排除異己抗原物質(zhì)的一種生理功能。
既有有利一面，也有有害一面。
2、免疫反應分類
1)非特異性免疫與特異性免疫
非特異性免疫是機體對所有病原微生物都有防御作用，沒有特殊的選擇性。它受遺傳控制，是機體在長期的種系發(fā)育與進化過程中逐漸建立起來的一系列防衛(wèi)機能，在個體一出生就具有。
又稱天然免疫（先天免疫)
特異性免疫是指機體針對某一種或某一類微生物或其產(chǎn)物所產(chǎn)生的特異性抗力。
是個體在生活過程中通過隱性感染或預防接種等方式，使抗原與免疫系統(tǒng)的細胞相接觸后而獲得的防衛(wèi)機能。又稱后天獲得性免疫
2)自動免疫與被動免疫
自動免疫是指用人工方法注射抗原（菌苗、疫苗、類毒素)，使機體產(chǎn)生免疫功能。
被動免疫是指用人工方法注射抗體（抗毒素、抗血清)而產(chǎn)生對病原體的抵抗力。
3)細胞免疫與體液免疫
細胞免疫是指致敏淋巴細胞與其相應抗原作用所產(chǎn)生的特異性免疫。
體液免疫是抗體的免疫作用。
3、免疫的功能
1)生理防御功能（免疫防御)
2)自身穩(wěn)定功能（免疫穩(wěn)定)
3)免疫監(jiān)視作用(及時排除突變細胞。)
（三)環(huán)境因素
P325表解
2節(jié)：非特異性免疫
一、機體的天然屏障作用
1、皮膚和粘膜（體外屏障)
2、內(nèi)部屏障
二、吞噬細胞
白細胞分類：P327，表10-4，圖10-1
1、噬中性粒細胞：吞噬過程。圖10-2
2、巨噬細胞：來源、功能。
三、炎癥反應
四、體液因素（正常體液中的抗微生物因素)：P330，表10-5
1、補體系統(tǒng)
補體是存在于正常血清中一組具有酶活性的蛋白，有補充抗體作用能力，其作用無特異性，可與抗原抗體復合物作用，不能單獨作用于抗原或抗體。補體由巨噬細胞、腸上皮細胞及肝、脾細胞產(chǎn)生。
補體系統(tǒng)由11個血清蛋白構(gòu)成，C1-C9，C1又分C1q、C1r、C1s。是一組酶原，被激活后發(fā)揮作用。
補體攻擊細胞結(jié)果，使膜損傷，導致細胞裂解。促進吞噬作用。與變態(tài)反應有關。
(2)干擾素 interferon IFN
干擾素是一類在同種細胞上具有抗病毒活性的蛋白質(zhì)，其活性發(fā)揮又受細胞基因組的調(diào)節(jié)和控制，涉及到RNA和蛋白質(zhì)合成。
人干擾素有α干擾素（白細胞干擾素)，β干擾素（成纖維細胞干擾素)，γ干擾素（免疫干擾素)。
干擾素誘生劑：P331
天然干擾素是分子量為2萬的糖蛋白，其作用無特異性，但產(chǎn)生干擾素的動物和被保護的動物之間卻有種屬特異性。不過也有交叉保護作用。干擾素作用時間短，僅幾天。
作用機制：P331,圖10-3
主要抑制病毒的復制，其可激活宿主DNA,產(chǎn)生抗病毒蛋白（AVP)，與核糖體作用，使其只能合成宿主蛋白，而不能合成病毒蛋白。
3節(jié)：特異性免疫
一、參與特異性免疫的組織器官
胸腺、腔上囊、骨髓、淋巴結(jié)、脾臟。前三者稱中央淋巴組織，后二者稱外周淋巴組織。
二、參與特異性免疫的細胞
免疫活性細胞是指在免疫過程中受抗原刺激后能進行分化、增殖并發(fā)生特異性免疫應答的T、B細胞。
免疫細胞主要是各類淋巴細胞、巨噬細胞等
免疫細胞均來源于骨髓干細胞。
1、干細胞：分化圖 P336，圖10-5
2、T淋巴細胞（胸腺依賴淋巴細胞)
T細胞發(fā)育過程（細胞免疫)
T細胞表面標志：綿羊紅細胞（sRBC)受體、有絲分裂原受體等。
T細胞分類：
T調(diào)節(jié)細胞 輔助性T細胞(TH)
(TR) 抑制性T細胞（TS)
T效應細胞 遲發(fā)型超敏T細胞(TD)
(TE) 細胞毒T細胞(TC)
2、B淋巴細胞（骨髓依賴淋巴細胞)
發(fā)育過程:體液免疫
標志：膜表面免疫球蛋白SmIg。
還有一些淋巴細胞，如K細胞、NK細胞等。
3、巨噬細胞
在特異性免疫中，淋巴細胞不易直接接觸抗原，須經(jīng)巨噬細胞吞噬消化，將抗原信息傳遞給淋巴細胞。此外，巨噬細胞還能釋放白細胞介素-1，參與免疫。
三、特異性體液免疫
由抗體介導的免疫
1、中和外毒素
2、調(diào)理作用
3、凝集作用
4、阻止病原菌對粘膜的吸附
四、特異性細胞免疫
致敏T淋巴細胞介導的
1、 TD細胞的作用：釋放淋巴因子，其作用于免疫活性細胞而產(chǎn)生免疫效應。
主要的淋巴因子：表10-8
淋巴因子作用無特異性，但其釋放需特異性抗原刺激。
2、 TC 細胞作用：能特異性地識別靶細胞表面抗原，與其結(jié)合，使其溶解。
