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（二）酶分析法
酶分析法是一種以酶為分析工具（或試劑）的分析方法。分析的對(duì)象可以是酶的底物、輔酶活化劑甚至酶的抑制劑。在進(jìn)行這類分析時(shí)，先要根據(jù)分析對(duì)象選擇適宜的“工具酶”，然后再通過(guò)酶反應(yīng)的測(cè)定，并借助相應(yīng)的校正曲線來(lái)測(cè)定它們的濃度或含量。在上述幾種檢測(cè)對(duì)象中，除了底物可以采用總變量分析法外，其他都只能用動(dòng)力學(xué)分析法。
1．動(dòng)力學(xué)分析法這種分析法的原理是：通過(guò)條件控制，分別使底物、輔酶活化劑或抑制劑的濃度在酶反應(yīng)中起決定反應(yīng)速度的主導(dǎo)作用，這時(shí)酶反應(yīng)速度和上述相應(yīng)因素的濃度間將具有確定的比例關(guān)系，這樣測(cè)定酶反應(yīng)的速度就可求出它們的濃度。酶分析法采用的條件和酶活力測(cè)定法的條件基本相同，但其所用的酶量必須一定．被測(cè)物以外的其他反應(yīng)成分均須保證處于恒定和最適。以下分別簡(jiǎn)述各種物質(zhì)測(cè)定應(yīng)注意的問題。
�。�1）被測(cè)物是酶的底物：當(dāng)?shù)孜餄舛龋跾］〈km時(shí)，酶反應(yīng)相對(duì)底物而言具有一級(jí)反應(yīng)性態(tài)，即酶反應(yīng)速度與底物濃度成正比，u＝k·［S］，因此測(cè)定酶反應(yīng)速度可以得知其濃度。
（2）被測(cè)物是輔酶：需要NAD（P）、coA之類輔酶的反應(yīng)可看作是雙底物反應(yīng)，這些輔酶可看作是底物之一。當(dāng)另一類底物濃度足夠高時(shí)，反應(yīng)變?yōu)閱蔚孜锓磻?yīng)；那么反應(yīng)速度將與其成正比。以CoA的測(cè)定為例，它是α-酮戊二酸脫氫酶的輔酶：
此反應(yīng)可通過(guò)340nm吸收度的變化來(lái)測(cè)定，當(dāng)另外二種底物處于足夠高的濃度時(shí)，反應(yīng)速度與CoA的濃度成正比。
�。�3）被測(cè)物為活化劑：當(dāng)其他條件最適且一定時(shí)，活化劑在低濃度范圍內(nèi)，酶反應(yīng)速度隨活化劑濃度增大而升高，并在一定范圍內(nèi)具有線性比例關(guān)系。但是用動(dòng)力學(xué)方法測(cè)定時(shí)有兩個(gè)問題應(yīng)注意：①活化劑濃度超過(guò)一定水平后常導(dǎo)致抑制；②對(duì)于某一種酶，相似的離子往往也能表現(xiàn)出活化作用，因此測(cè)定不專一，易受到干擾。
（4）被測(cè)物是抑制劑：不可逆抑制劑對(duì)酶反應(yīng)產(chǎn)生的抑制程度隨抑制劑濃度呈線性增加，而且酶反應(yīng)的最終抑制程度由抑制劑的絕對(duì)量決定；可逆抑制劑在底物濃度一定時(shí)，在低的抑制劑濃度范圍內(nèi)，酶反應(yīng)速度隨抑制劑濃度升高呈線性降低。因此均可以用動(dòng)力學(xué)方法測(cè)定，而且測(cè)定往往極為靈敏。例如，膽堿酯酶能用于檢測(cè)10－l0g水平的有機(jī)磷化合物。這種測(cè)定應(yīng)注意的是：某些抑制劑能抑制多 種酶；而有些酶能被幾種相似的抑制劑所控制，因而如果“工具酶”選擇不當(dāng)，就易受到干擾。
對(duì)酶分析法來(lái)說(shuō)，在建立了適宜的反應(yīng)和測(cè)定系統(tǒng)后，還必須制備一條酶反應(yīng)速度相對(duì)于相應(yīng)的被測(cè)物濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以便對(duì)未知樣品的量進(jìn)行檢測(cè)。值得強(qiáng)調(diào)的是，在測(cè)定未知樣品時(shí)，所采用的反應(yīng)、測(cè)定系統(tǒng)和制備標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)所用的系統(tǒng)應(yīng)完全相同，而且待測(cè)樣品的濃度還應(yīng)控制在這一曲線范圍以內(nèi)。
2．總變量分析法又稱為平衡法或終點(diǎn)法。這是根據(jù)被測(cè)物質(zhì)的性質(zhì)，選擇適宜的分析工具酶對(duì)該物質(zhì)進(jìn)行作用，然后在反應(yīng)完成后，借助物理化學(xué)方法測(cè)出其總變化量，并參考反應(yīng)的平衡點(diǎn)，計(jì)算出被測(cè)物的實(shí)際含量或濃度的一種分析方法。僅適用于底物物質(zhì)的測(cè)定，應(yīng)用時(shí)應(yīng)考慮工具酶的用量與反應(yīng)的平衡點(diǎn)。
終點(diǎn)法要獲得好的測(cè)定結(jié)果，重要條件是：①被測(cè)底物的濃度應(yīng)很小，并控制反應(yīng)于1級(jí)反應(yīng)水平。因?yàn)檫@樣可以使反應(yīng)速度達(dá)到平衡點(diǎn)；防止過(guò)多的產(chǎn)物生成，避免逆反應(yīng)。②其它因素應(yīng)盡量處于最適水平，雙底物反應(yīng)的另一底物應(yīng)具有足夠高的濃度。③酶的用量要高，以保證反應(yīng)較快地達(dá)到終點(diǎn)。
酶比較昂貴，因此有一個(gè)適宜的用量問題。一般而言，工具酶用量可控制在1～2 km單位（U／m1）左右。而終點(diǎn)法的測(cè)定時(shí)間多控制在2～10min。
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示例一 胰蛋白酶效價(jià)測(cè)定
本品系自牛、羊、豬的膜中提取的蛋白水解酶。按干燥品計(jì)算，每1mg的效價(jià)不得少于2500單位。
胰蛋白酶能專一地作用于賴氨酸、精氨酸等堿性氨基酸的羧基組成的肽鍵，酰胺鍵及酯鍵，其水解速率為酶鍵〉酰胺鍵＞肽鍵。也可水解間位經(jīng)基苯甲酸酶及脂肪酸酶，以及變性蛋白如酶蛋白、血紅蛋白。因此可選用酪蛋白或含有堿性氨基酸的酰胺、酶等作為底物測(cè)定其酶活力。因酶蛋白可被很多蛋白水解酶水解，缺乏專一性，故目前均采用專屬性較離的N-苯甲酰酰－L精氨酸乙酯（BAEE）作為本品的底物。
供試品溶液的制備 精密稱取本品適量，用0.001mol/L鹽酸液溶解并制成每1m1中含50～60胰蛋白酶單位的溶液。
底物溶液的制備取N-苯甲酰-L精氨酸乙酯鹽酸鹽85.7mg，加水溶解使成100ml，作為底物原液；精密量取10ml，用磷酸鹽緩沖液（取0.067mmol/L磷酸二氫鉀溶液13ml與0.067mol／L磷酸氫二鈉溶液87ml混合，pH7.6）稀釋成100ml，恒溫于25.0±0.5℃，在253nm波長(zhǎng)處，以水做空白，測(cè)定吸收度，必要時(shí)可用磷酸鹽緩沖液（pH7.6）或上述底物原液調(diào)節(jié)，使吸收度在0.575～0.585之間，作為底物溶液。底物溶液應(yīng)在制成2h內(nèi)使用。
測(cè)定法取底物溶液3.0ml與0.001mOl／L鹽酸液0.2ml，混勻，作為空白。另取供試品溶液0.2ml與底物溶液（預(yù)熱至25±0.5℃） 3.0m1，立即計(jì)時(shí)并搖勻，比色池內(nèi)的溫度應(yīng)保持在25士0.5℃，在253nm波長(zhǎng)處，每隔30s讀取吸收度，共5min。以吸收度為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)，作圖；每30s吸收度的改變應(yīng)恒定在0.015～0.018之間，呈線性關(guān)系的時(shí)間不得少于3min。若不符合上述要求，應(yīng)調(diào)整供試品溶液的濃度，重新測(cè)定。在上述吸收度對(duì)時(shí)間的關(guān)系圖中，取呈直線部分上的吸收度，按下式計(jì)算：
（公式）
式中P：為每1mg胰蛋白酶供試品中含胰蛋白酶的單位數(shù)；A1為直線上終止的吸收度；A2為直線上開始的吸收度；T為A1至A2讀數(shù)的時(shí)間（min）；W為測(cè)定液中含供試品的mg數(shù)；0.003為在上述條件下，吸收度每分鐘改變0.003，即相當(dāng)于1個(gè)胰蛋白酶單位。
影響效價(jià)測(cè)定的因素
�。�1）酶濃度：在固定底物濃度、反應(yīng)溫度、pH等條件下，調(diào)整反應(yīng)液的酶濃度是效價(jià)測(cè)定的關(guān)鍵，酶濃度過(guò)高或過(guò)低都不能使反應(yīng)速率保持恒定，最佳的測(cè)定濃度為50～60IU／ml。
�。�2）溫度：溫度變化對(duì)酶促反應(yīng)速率較敏感，溫度每升高1℃，活力單位約增高5％，反之，則下降。為準(zhǔn)確控制反應(yīng)溫度，除調(diào)節(jié)水浴 溫度或室溫外，由于在測(cè)定時(shí)受儀器散熱和光照等影響，故必須隨時(shí)測(cè)量比色池內(nèi)反應(yīng)物的溫度，以保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。
�。�3）底物：因BAEE酶鍵易水解，其水溶液不穩(wěn)定，故該底物溶液應(yīng)在配制后3h內(nèi)使用BAEE底物測(cè)定本品酶活力，操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確度高，RSD一般可控制在5％以下。
示例二 胃蛋白酶的活力測(cè)定［3］
本品系自豬、羊或牛的胃粘膜中提取的胃蛋白酶，具有催化蛋白質(zhì)水解的能力。在實(shí)驗(yàn)條件下，胃蛋白酶催化血紅蛋白水解生成不被三氯醋酸所沉淀的氨基酸。利用水解產(chǎn)物中芳香氨基酸如苯丙氨酸、酶氨酸和色氨酸有紫外吸收，用紫外分光光度法直接測(cè)定，并計(jì)算出本品的酶活力。每1g檢品中含蛋白酶活力不得少于 3800單位。
對(duì)照品溶液的制備 精密稱取經(jīng)105℃干燥至恒重的酪氨酸適量，加鹽酸溶液（取1mol／L鹽酸溶液65時(shí)，加水至1000ml）制成每1ml中含0．5mg的溶液。 醫(yī)學(xué).全在線gydjdsj.org.cn
供試品溶液的制備 取本品適量，精密稱定，用上述鹽酸溶液制成每1ml中約含0.2～0.4單位的溶液。
測(cè)定法取試管6支，其中3支各精密加入對(duì)照品溶液1時(shí)，另3支各精密加入供試品溶液1ml，置37土0.5℃水浴中，保溫5min，精密加入預(yù)熱至37± 0.5℃的血紅蛋白試液5ml，搖勻，并精確計(jì)時(shí)，在37土0.5℃水浴中反應(yīng)10min。立即精密加入5％三氯醋酸溶液5ml，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液備用。另取試管2支，各精密加入血紅蛋白試液5ml，置37±0.5℃水浴中保溫10min，再精密加入5％三氯醋酸溶液5ml，其中1支加供試品溶液 1ml，另1支加上述鹽酸溶液1ml，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，分別作為供試品和對(duì)照品的空白對(duì)照，照分光光度法，在275nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，算出平均值A(chǔ)s和A，按下式計(jì)算：
（公式）
式中：Ws為1ml對(duì)照品溶液中含酶氨酸的量（μg）； W為供試品取樣量（g）； n為供試品的稀釋倍數(shù)；A，As分別為對(duì)照品溶液及供試品溶液吸收度的平均值；181.19為酪氨酸的分子量。
在上述條件下，每分鐘能催化水解血紅蛋白生成1μmol酶氨酸的酶量，為一個(gè)蛋白酶活力單位。
本法是通過(guò)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和正交試驗(yàn)研究，確定酶和作用物的濃度、反應(yīng)時(shí)間、溫度和pH等最佳反應(yīng)條件而建立的，具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。測(cè)定時(shí)，濾液須澄清，否則將影響結(jié)果的準(zhǔn)確度及精密度。
影響效價(jià)測(cè)定的因素
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