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執(zhí)業(yè)藥師資格考試網(wǎng)藥物分析輔導(dǎo)：常用定量分析法與應(yīng)用——電泳法 | |||||
| 來源：醫(yī)學(xué)全在線 更新：2007-5-20 考研論壇 | |||||
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�。ㄒ唬╇娪痉ǖ幕驹砗头诸� 在電解質(zhì)溶液中，帶電粒子或離子在電場作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反方向遷移的現(xiàn)象叫電泳。 電泳分離是基于溶質(zhì)在電場中的遷移速度不同而進(jìn)行的。一個離子在電場中的移動速度為（公式） （式中解釋） 根據(jù)電泳的分離特點(diǎn)及工作方式，電泳可分為三大類： （l）自由界面電泳：在二根U形管里的溶液中，同種分子的構(gòu)型及荷電情況基本一致，在電場影響下，它們逐漸密集而與其他電泳遷移率不同的物質(zhì)之間形成明顯的界面。 �。�2）區(qū)帶電泳：在電泳過程中，應(yīng)用各種不同的惰性支持介質(zhì)，在電場作用下，使具有不同泳動速度的組分形成各自區(qū)帶的電泳。根據(jù)所用的支持物不同可分為：紙電泳法、醋酸纖維素薄膜電泳法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法和十二烷基硫酸納（SDS）聚丙烯酰胺凝膠電泳法。 �。�3）高效毛細(xì)管電泳：是在一根內(nèi)徑約50μm的毛細(xì)管中，在高壓電場下進(jìn)行樣品分離分析的一種新型電泳技術(shù)。 �。ǘ┏Ｓ秒娪痉ǖ念愋图捌鋺�(yīng)用 1．紙電泳法紙電泳法是用濾紙作為支持介質(zhì)的一種電泳法，其操作要點(diǎn)如下： �。�1）緩沖液的選擇：應(yīng)根據(jù)供試品的理化特性，需要的電泳速度和分辨力，選擇適宜的緩沖液、pH值和離子強(qiáng)度。 （2）濾紙的裁剪：濾紙可按需要裁成與電泳槽相當(dāng)?shù)拈L方形或長條形，樣點(diǎn)的間距為2～3cm，濾紙長度視電源輸出最高電壓及所需的電場強(qiáng)度而定，電壓恒定時，所需場強(qiáng)越大，濾紙裁得越短。 �。�3）點(diǎn)樣方法：分干點(diǎn)法與濕點(diǎn)法。干點(diǎn)法是將供試品溶液點(diǎn)于濾紙上，吹干，再點(diǎn)，反復(fù)數(shù)次直至點(diǎn)完規(guī)定量的供試品溶液，然 后用噴霧器將濾紙噴濕，點(diǎn)樣處最后噴濕。干點(diǎn)法能濃縮供試品，適用于稀的供試品溶液。濕點(diǎn)法是將濾紙全部浸入緩沖液中，濕潤后，取出，用濾紙吸干多余的緩沖液，濾紙點(diǎn)樣部分需用架子架起，點(diǎn)的次數(shù)不宜過多，稀的供試品溶液應(yīng)預(yù)先濃縮。濕點(diǎn)法優(yōu)點(diǎn)是可保持供試品的天然狀態(tài)，點(diǎn)樣后立即接通電源以免擴(kuò)散。 �。�4）電泳及區(qū)帶顯示：將點(diǎn)好的濾紙放電泳槽上�？刂齐妷�、電流和電泳時間。電泳后，濾紙從槽中取出，晾干或烘干。不同的供試品采用不同的顯色方法，如核苷酸類藥物可直接在紫外光燈下觀察定位，而有些物質(zhì)必須用顯色劑顯色。 �。�5）定量測定：紙電泳的定量方法與紙色譜的定量方法一樣，可以用洗脫法或光密度計掃描法進(jìn)行。但目前光密度計掃描法已被醋酸纖維素薄膜電泳法取代。這是因?yàn)樵诩堧娪痉ㄖ�，支持物濾紙對蛋白質(zhì)樣品的吸附力較大，且濾紙本身為極性物，透明化步驟較煩，不利于光密度計掃描法定量測定。 紙電泳法可用于蛋白質(zhì)、核苷酸等生化藥物的測定。如核苷酸，具有共軛雙鍵的嘌呤或嘧啶堿基，在一定的pH條件下，具強(qiáng)紫外吸收，電泳后濾紙在紫外光燈下顯示紫色，用鉛筆定位，剪下相應(yīng)的部位，進(jìn)行洗脫，在特定波長下測定供試品的吸收度，按其吸收系數(shù)可計算出某一核苷酸的含量。三磷酸腺苷二鈉（ATP）的含量測定即屬于此類。 ATP在生產(chǎn)中易帶入ADP等雜質(zhì)，儲存中也易分解成ADP，因而采用紙電泳分離ATP后的分光光度法進(jìn)行測定。測定方法如下： 取本品，精密稱定，加水制成每1ml中約含10mg的溶液，照中國藥典附錄紙電泳法測定。電泳畢，取出吹干，置紫外光燈（254nm）下檢視，用鉛筆劃出跑在濾紙最前面的紫色斑點(diǎn)，剪下供試品斑點(diǎn)和與斑點(diǎn)面積相近的空白濾紙并剪成細(xì)條，分別放入試管中，精密加入0.01mol／L鹽酸液5ml，攪勻，放置 1R，待紙纖維全部下沉，傾取上清液，照分光光度法，在257士1nm波長處測定吸收度，減去濾紙空白吸收度的平均值，按C的吸收系數(shù)（E）為263計算含量。 2．醋酸纖維素薄膜電泳法 本法是用醋酸纖維素薄膜為支持物的一種電泳方法。醋酸纖維素薄膜是纖維素的羥基乙酰化形成的纖維素醋酸酯，將其溶于有機(jī)溶劑后，涂抹而成的均勻薄膜。醋酸纖維素薄膜電泳己應(yīng)用于血清蛋白、脂蛋白等的分離和定量測定。 3．聚丙烯酰胺電泳法聚丙烯酰胺電泳法（簡稱PAGE）是以人工合成的聚丙烯酰胺作為惰性支持介質(zhì)的電泳方法。其分離效果主要取決于分子所帶電荷與分子大小的比例，也取決于與分子量大小有關(guān)的分子篩效應(yīng)。PAGE依電泳槽和凝膠層中的緩沖液體系pH和凝膠孔徑大小是否一致而加以區(qū)別，相同的為連續(xù)體系，不相同的為不連續(xù)體系。圓盤電泳屬于后者。 PAGE與其他電泳法比較具有如下優(yōu)點(diǎn)：①電泳區(qū)帶狹窄不易擴(kuò)散，供試品用量極微，電泳分離時間短，設(shè)備簡單，分辨率高，重復(fù)性佳，已廣泛用于酶、蛋白、聚核苷酸、多肽的分析鑒定和少量制備。②凝膠是以單體-烯酰胺和交聯(lián)劑．甲撐雙丙烯酰胺聚合而成的縱鏈交錯的且有“分子篩效應(yīng)的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)”。其機(jī)械性能優(yōu)良，對熱穩(wěn)定，無色透明，無雜質(zhì)，不溶于緩沖液，在280nm波長處無紫外吸收。電泳時無電滲和吸附作用，適于供試品的定量和精制。 醫(yī)學(xué)全.在線gydjdsj.org.cn 4． SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法（簡稱SDELPAGE） SDSPAGE是測定蛋白和酶等大分子物質(zhì)分子量的有效方法。其原理是根據(jù)大多數(shù)蛋白都能與陽離子表面活性劑十二烷基硫酸納（SDS）按重量比結(jié)合成復(fù)合物，使蛋白分子所帶的負(fù)電荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過天然蛋白分子的負(fù)電荷，消除了不同蛋白分子的電荷效應(yīng)，使蛋白分子相對遷移率（Ri）的大小完全取決于分子量的高低，可從已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的對數(shù)和相對遷移率所作的標(biāo)準(zhǔn)曲線中求出供試品的分子量。 SDSPAGE的優(yōu)點(diǎn)是設(shè)備簡單、操作方便、試劑易得、誤差較小、重復(fù)性好。該法可用常規(guī)染色法，亦可用紫外吸收掃描法進(jìn)行分子量測定、電泳純度檢查和電泳成分百分含量測定。 5．瓊脂糖凝膠電泳法 瓊脂糖凝膠電泳是以瓊脂糖為基質(zhì)的一種電泳方法�，F(xiàn)簡述如下： �。�1）制膠：取瓊脂糖約0.2g，加水10ml置水洛加熱使溶脹完全，然后加入溫?zé)岬拇姿?鹽鹽緩沖液（pH3.0），混勻，趁熱將膠液涂布于大小適宜（7.5cm×2.5cm或9cm×4m）的玻璃板上，厚度約3mm，靜置，待凝膠結(jié)成無氣泡的均勻薄層，即得。 �。�2）標(biāo)準(zhǔn)晶溶液及供試品溶液的制備：照各藥品項下規(guī)定配制。 �。�3）點(diǎn)樣與電泳：在電泳槽內(nèi)加入醋酸．鋰鹽緩沖液（pH3.0），將凝膠板置于電泳槽架上，經(jīng)濾紙橋浸入緩沖液。于凝膠板極端分別點(diǎn)樣1μl，立即接通電源，在電壓梯度約30V／cm，電流強(qiáng)度1～2mA/cm的條件下，電泳約20min，關(guān)閉電源。 �。�4）染色與脫色：取下凝膠板，用甲苯胺藍(lán)溶液（0.1％，W／V）染色，用水洗去多余的染色液至背景無色為止。 �。�5）定量：選擇適宜的檢測方法如分光光度法等，以標(biāo)準(zhǔn)晶對照法進(jìn)行樣品的含量測定。 （6）應(yīng)用：由于瓊脂糖凝膠具有較大孔徑，因此，瓊脂糖凝膠電泳法特別適用于RNA、DNA等核糖核酸類及其衍生物類藥物的分離。 |
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| 文章錄入：凌云 責(zé)任編輯：凌云 | |||||
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