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酶法通常包括兩種類型：一種是以酶為分析對象的分析，這就是通常所說的“酶活力測定法”；另一種是以酶為分析工具或分析試劑的分析，一般可稱為“酶分析法”。前者的目的在于測定樣品中某種酶的含量或活性；后者則主要用酶作試劑測定樣品中酶以外的其它物質(zhì)的含量。二者檢測的對象雖有所不同，但原理和方法都是以酶能專一而高效地催化某化學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過對酶反應(yīng)速度的測定或?qū)ι晌锏葷舛鹊臏y定而檢測相應(yīng)物質(zhì)的含量。
�。ㄒ唬┟富盍y定法
1．基本概念 所謂酶活力，是指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力。酶活力的測定實際上是測定一個被酶所催化的化學(xué)反應(yīng)的速度。酶反應(yīng)的速度可以用單位時間反應(yīng)底物的減少或產(chǎn)物的增加來表示，酶反應(yīng)的速度愈快所表示的酶活力愈高。
測定酶活力，可用物理法，化學(xué)法或酶分析法等方法。常用的方法有：第一，在適當(dāng)?shù)臈l件下，把酶和底物混合，測定生成一定量產(chǎn)物所需的時間，此即終點法。第二，將酶和底物混合后隔一定時間，間斷地或連續(xù)地測定反應(yīng)的連續(xù)變化，如吸收度的增加或減少。第 三，將酶與底物混合后，讓其反應(yīng)一定時間，然后停止反應(yīng)，定量測定底物減少或產(chǎn)物生成的量。后兩種方法稱為動力學(xué)法或反應(yīng)速率法：按取樣及檢測的方式可稱為取樣測定法或連續(xù)測定法。
酶的活性單位（國際單位IU）：是指在25℃下，以最適的底物濃度、最適的緩沖液離子強度以及最適的pH值諸條件下，每分鐘能轉(zhuǎn)化一個微摩爾底物的酶量定為一個活性單位。酶的比活性即定為一毫克酶的活性單位。
在實際工作中，為了簡便，人們往往采用各自習(xí)慣沿用的單位，有時甚至可直接用測得的物理量表示，例如，以吸收度的變化值（AA／At）表示酶單位。其它衍生單位：酶溶液的濃度通常以單位數(shù)／毫升表示；在估計酶制劑純度時則用比活力，即以單位重量的酶蛋白中酶的單位數(shù)［（單位數(shù)／毫克蛋白（或氮）］表示；在酶高度純凈，而且酶的分子量已知，甚至每個酶分子上的活性中心數(shù)目也已 知時，還可采用分子活力或轉(zhuǎn)換率表示。它們分別表示在最適條件下每個酶分子或每個活性中心每分鐘催化底物分子（或相關(guān)基因）轉(zhuǎn)化的數(shù)目，這種單位的意義是它可用以進行催化效率的估計和比較。
2．酶促反應(yīng)的條件 選擇反應(yīng)條件的基本要求是：所有待測定的酶分子都應(yīng)該能夠正常地發(fā)揮它的作用。這就是說，反應(yīng)系統(tǒng)中除了待測定的酶濃度是影響速度的唯一因素外，其它因素都處于最適于酶發(fā)揮催化作用的水平。確定反應(yīng)條件時應(yīng)考慮以下因素：
�。�1）底物：為了便于測定，選用的底物（包括人工合成底物）最好在物理化學(xué)性?上和產(chǎn)物不同。關(guān)于測定用的底物濃度，為了不使酶反應(yīng)速度受它的限制，反應(yīng)系統(tǒng)應(yīng)該使用足夠高的底物濃度，判別標準是底物濃度［S］與km的關(guān)系（km稱為米氏常數(shù)，是重要的酶反應(yīng)動力學(xué)常數(shù)）。例如一般選用底物的濃度［S］＝ lookm，因為在這種情況下反應(yīng)速度可達最大速度的99％。大多數(shù)酶具有相對的專一性，在可被它作用的各種底物中一般選擇Km小的作測定的底物。
�。�2）pH：氫離子濃度能對酶反應(yīng)產(chǎn)生多種影響：它可能改變酶的活性中心的解離狀況，升高或降低酶的活性；也可能破壞酶的結(jié)構(gòu)與構(gòu)象導(dǎo)致酶失效；還可能作用反應(yīng)系統(tǒng)的其它組成成分影響酶反應(yīng)，甚至改變可逆反應(yīng)進行的方向。例如，乳酸脫氫酶反應(yīng)在pH7時傾向乳酸生成，而pH10時則傾向于丙酮酸形成。因此在進行酶活力測定時要注意選擇適宜的反應(yīng)pH，并將反應(yīng)維持在這一pH值。
酶反應(yīng)通常借助緩沖系統(tǒng)來控制pH，因而有一個適宜的緩沖離子和離子強度問題。選擇緩沖離子應(yīng)考慮以下幾個問題：①選擇的離子的pk值須接近要調(diào)整的 pH，因為在這種情況下，緩沖能力最強。②緩沖離子不同，即使是同一酶反應(yīng)所表現(xiàn)出來的活性水平可能各不相同，甚至最適pH也可能發(fā)生變化。③緩沖離子可能與酶活性的必需成分形成絡(luò)合物而導(dǎo)致酶活性的抑制。例如，磷酸能與多價陽離子如Ca2+等結(jié)合，硼酸能與多種有機化合物結(jié)合，從而抑制相應(yīng)的酶活性。④ 緩沖體系常因稀釋和溫度等變化改變其pH值。
�。�3）溫度：酶反應(yīng)對溫度十分敏感，因為溫度能直接影響化學(xué)反應(yīng)速度本身，也能影響酶的穩(wěn)定性，還可能影響酶的構(gòu)象和酶的催化機制。一般而言，溫度變化 1℃，酶反應(yīng)速度可能相差5％左右。因此，實驗中溫度變動應(yīng)控制在土0．1℃以內(nèi)。酶反應(yīng)的溫度通常選用25℃、30℃或37℃。 醫(yī)學(xué).全在.線www.med126.com
（4）輔助因子：有些酶需要金屬離子，有些酶則需要相應(yīng)的輔酶物質(zhì)。為了提高酶在反應(yīng)系統(tǒng)中的穩(wěn)定性，有些也需要某些相應(yīng)的物質(zhì)。例如，對巰基酶可加入二巰基乙醇、二巰基蘇糖醇（DTT）等。
�。�5）空白和對照：每個酶反應(yīng)通常都應(yīng)該有適當(dāng)?shù)目瞻缀蛯φ�。空白是指雜質(zhì)反應(yīng)和自發(fā)反應(yīng)引起的變化量，它提供的是未知因素的影響�？瞻字悼赏ㄟ^不加酶，或不加底物，或二者都加（但酶需預(yù)先經(jīng)過失效處理）。對照是指用純酶或標準酶制劑測得的結(jié)果，主要作為比較或標定的標準。
3．酶活力的測定方法確定了適宜的反應(yīng)條件后，為了獲得正確的結(jié)果還需要有適當(dāng)?shù)臏y定方法。測定方法有取樣測定和連續(xù)測定法。取樣測定法是在酶反應(yīng)開始后不同的時間，從反應(yīng)系統(tǒng)中取出一定量的反應(yīng)液，并用適當(dāng)?shù)姆椒ㄍＶ蛊浞磻?yīng)后，再根據(jù)產(chǎn)物和底物在化學(xué)性質(zhì)上的差別，選用適當(dāng)?shù)臋z測方法進行定量分析，求得單位時間內(nèi)酶促反應(yīng)變化量的方法。連續(xù)測定法則是基于底物和產(chǎn)物在物理化學(xué)性?上的不同，在反應(yīng)過程中對反應(yīng)系統(tǒng)進行直接連續(xù)檢測的方法。，顯然從準確性和測定效率看連續(xù)法都比較好�，F(xiàn)簡述下�！�
�。�1）取樣測定法：在該方法中停止酶反應(yīng)通常采用添加酶的變性劑的辦法，如加5％的三氯醋酸、3％的高氯酸或其它酸、堿、醇類。三氯醋酸是一種高效專一的蛋白質(zhì)變性劑和沉淀劑，其缺點是在紫外光區(qū)有吸收，而高氯酸沒有此缺點，并且用氫氧化鈉中和、冷卻后，KCl04還可沉淀除去，但它不適于對酸和氧化劑敏感的測定對象。用于停止反應(yīng)的試劑應(yīng)根據(jù)具體反應(yīng)靈活掌握，例如，以對硝基酚的衍生物作底物的酶反應(yīng)可用氫氧化鈉或氫氧化鉀停止反應(yīng)，因為堿有利于硝基酚發(fā)色。另一種停止反應(yīng)的辦法是如熱使酶失效。
在取樣測定法中應(yīng)用何種具體的檢測方法要根據(jù)具體的酶反應(yīng)而定。常用的檢測方法有可見．紫外分光光度法、熒光分析法等。
取樣測定法比較古老，但目前仍廣泛采用，這是因為：①它不需要特殊儀器；②幾乎所有酶反應(yīng)都可根據(jù)產(chǎn)物或底物的化學(xué)性質(zhì)找出具體測定方法：③由于色源底物和熒光源底物的發(fā)展，可在原來的底物分子上接上相應(yīng)的有色基團、發(fā)色基團或熒光基團。例如，在淀粉等多糖分子上接上染料用于淀粉酶、溶菌酶等測定；在磷酸或核苷酸分子上接上硝基酚用于磷酸酯酶等測定。
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