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�。�2）連續(xù)測(cè)定法
1）紫外-可見(jiàn)分光光度法：這是根據(jù)產(chǎn)物和底物在某一波長(zhǎng)或波段上，有明顯的特征吸收差別而建立起來(lái)的連續(xù)檢測(cè)方法。
吸收度測(cè)定應(yīng)用的范圍很廣，幾乎所有氧化還原酶都可用此法測(cè)定。例如，脫氫酶的輔酶NAD（P）H在340nm有吸收高峰，而其氧化型則無(wú)；細(xì)胞色素氧化酶的底物為細(xì)胞色素C，該物質(zhì)在還原態(tài)時(shí)，在550nm的摩爾吸收系數(shù)為2.18×104，而氧化型為0.80×104，故可利用這種吸收度差別來(lái)進(jìn)行測(cè)定。
吸收度測(cè)定法的特點(diǎn)是靈敏度高（可檢測(cè)到10－9摩爾水平的變化）、簡(jiǎn)便易行，測(cè)定一般可在較短的時(shí)間內(nèi)完成。
2）熒光分析法：它的原理是，如果酶反應(yīng)的底物與產(chǎn)物之一具有熒光，那么熒光變化的速度可代表酶反應(yīng)速度。
應(yīng)用此法測(cè)定的酶反應(yīng)有兩類：一是脫氫酶等反應(yīng)，它們的底物本身在酶反應(yīng)過(guò)程中有熒光變化，例如NAD（P）H的中性溶液發(fā)強(qiáng)的藍(lán)白色熒光（460nm），而NAD（P）＋則無(wú)。另一類是利用熒光源底物的酶反應(yīng)，例如可用二丁酰熒光素測(cè)定脂肪酶，二丁酰熒光素不發(fā)熒光，但水解后釋放熒光素。熒光分析法測(cè)得的酶活性水平通常以單位時(shí)間內(nèi)熒光強(qiáng)度的變化（AF／At）表示。熒光測(cè)定法的主要缺點(diǎn)是，熒光讀數(shù)與濃度間沒(méi)有確切的比例關(guān)系，而且常因測(cè)定條件如溫度、散射、儀器等而不同，所以如果要將酶活性以確定的單位表示時(shí)，首先要制備校正曲線，根據(jù)這曲線再進(jìn)行定量。
熒光分析法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度極高，它比光吸收測(cè)定法還要高2～3個(gè)數(shù)量級(jí)，因此特別適于酶量或底物量極低時(shí)的快速分析。
3）旋光度法：某些酶反應(yīng)過(guò)程常伴隨著旋光變化，在沒(méi)有其它更好的方法可用時(shí)，可考慮用旋光度測(cè)定法。
4）酶偶聯(lián)測(cè)定法：所謂酶偶聯(lián)法是應(yīng)用過(guò)量、高度專一的“偶聯(lián)工具酶”，使被測(cè)酶反應(yīng)能繼續(xù)進(jìn)行到某一可直接、連續(xù)、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確測(cè)定階段的方法。以和光學(xué)檢測(cè)法相偶聯(lián)的分析法為例：
�、俦粶y(cè)酶反應(yīng)的產(chǎn)物是某脫氫酶的底物。在這種情況下，可向反應(yīng)測(cè)定系統(tǒng)中加入足夠量的相應(yīng)的脫氫酶和輔酶，使反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行，然后通過(guò)NAD（P）H特征吸收變化而加以測(cè)定。例如，己糖激酶（HK）的測(cè)定就可在過(guò)量的葡萄糖－6－磷酸（G-6-P）脫氫酶�。℅6PDH）和NADP＋存在的條件下進(jìn)行：
�。ǚ磻�(yīng)式）
大約有50種左右的脫氫酶可以利用NAD＋和NADH，20多種脫氫酶能利用NADP+和NADPH用作偶聯(lián)指示酶。
有些情況下，被測(cè)反應(yīng)不能直接和上述脫氫酶反應(yīng)連起來(lái)，此時(shí)可再插入一個(gè)起聯(lián)結(jié)作用的輔助酶反應(yīng)。例如為了測(cè)定肌激酶就可用這樣的系統(tǒng)：
（反應(yīng)式）被測(cè)反應(yīng)
其中PEP、Pry和L分別代表磷酸烯醇丙酮酸、丙酮酸和乳酸；AMP、ADP和ATP分別為一磷酸、二磷酸和三磷酸腺苷。
②被測(cè)反應(yīng)物和其他有光學(xué)性質(zhì)改變的酶反應(yīng)偶聯(lián)。 如腺苷酸脫氨酶在催化AMP脫氨過(guò)程中對(duì)265nm的光伴隨有吸收度的降低，此酶專一于AMP，不作用ADP和ATP，因此在測(cè)定某些合成酶或激酶反應(yīng)時(shí)，它可用作偶聯(lián)指示酶；肌激酶的測(cè)定也可被利用：
應(yīng)用酶偶聯(lián)測(cè)定法最重要的是加入的偶聯(lián)工具酶應(yīng)該高度純凈、專一而且過(guò)量，使測(cè)得的反應(yīng)速度和酶濃度間有線性關(guān)系。至于偶聯(lián)指示 酶的用量一般應(yīng)為被測(cè)酶的100倍左右。
5）其他：其他檢測(cè)法有電化學(xué)測(cè)定法；離子選擇性電極測(cè)定法適用于產(chǎn)酸反應(yīng)中pH變化的測(cè)定；放射化學(xué)法的特點(diǎn)是靈敏度極高，可直接用于酶活性測(cè)定，缺點(diǎn)是操作繁而費(fèi)時(shí)。
4．測(cè)定過(guò)程中應(yīng)注意的問(wèn)題
�。�1）產(chǎn)物的測(cè)定：和一般化學(xué)反應(yīng)一樣，酶反應(yīng)速度可用單位時(shí)間內(nèi)反應(yīng)物（底物）的減少或產(chǎn)物的增加來(lái)表示：
其中s和p分別代表底物或產(chǎn)物濃度，t為時(shí)間。一般情況下，產(chǎn)物和底物的改變量是一致的。但是由于反應(yīng)系統(tǒng)中使用的底物往往是足夠過(guò)量的，而反應(yīng)時(shí)間通常又很短，底物的減少量?jī)H為總量的很小的百分?jǐn)?shù)，因此測(cè)定不易準(zhǔn)確；反之，產(chǎn)物從無(wú)到有，只要測(cè)定方法靈敏，準(zhǔn)確度可以很高，故以分析產(chǎn)物為好。
�。�2）反應(yīng)速度的測(cè)定：反應(yīng)速度可以單位時(shí)間內(nèi)底物的變化量表示。如果將測(cè)得的產(chǎn)物或底物變化量對(duì)時(shí)間作圖，可獲得“酶反應(yīng)進(jìn)程曲線”，這條曲線的斜率就代表酶反應(yīng)速度。
大多數(shù)酶的反應(yīng)進(jìn)程曲線表明，在酶反應(yīng)的最初階段里，底物或產(chǎn)物的變化量一般隨反應(yīng)時(shí)間而線性地增加，反應(yīng)速度恒定；但是反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，這條曲線會(huì)逐漸地彎曲下來(lái)，斜率發(fā)生改變，反應(yīng)速度下降。其原因是，底物濃度在下降，產(chǎn)物在增加，逆反應(yīng)從無(wú)到有逐漸變得顯著起來(lái)；同時(shí)酸、堿、熱等也在慢慢地使酶失效。因此，這種情況下測(cè)得的反應(yīng)速度已是一種表觀的、多種因素影響下的綜合結(jié)果，不能代表酶的真正活性。真正能代表酶催化活性的是反應(yīng)初始階段的速度，即反應(yīng)初速度。
要求得初速度，一般先要給一條酶反應(yīng)進(jìn)程曲線，并取其直線線段的斜率代表酶反應(yīng)初速度；如果這條直線線性不明顯，那末就應(yīng)沿曲線的最初部分畫(huà)出通過(guò)零點(diǎn)或外推到零點(diǎn)的切線，并以這條切線構(gòu)成的斜率代表酶反應(yīng)初速度。
進(jìn)程曲線可以通過(guò)連續(xù)測(cè)定得到，也可通過(guò)在間隔時(shí)間取樣測(cè)定繪制，它至少應(yīng)由三個(gè)時(shí)間點(diǎn)組成；零時(shí)點(diǎn)、適當(dāng)選擇的時(shí)間間隔（取決于具體的反應(yīng)和測(cè)定方法）以及二倍于這個(gè)間隔的點(diǎn)。并且要求在這種時(shí)間范圍內(nèi)反應(yīng)量不超過(guò)底物總量的20％。
（3）測(cè)定要達(dá)到的要求：酶活力測(cè)定的目的，就是要通過(guò)酶反應(yīng)速度的測(cè)定，求得酶的濃度或含量，因此，測(cè)得的反應(yīng)速度必須和酶濃度間有線性的比例關(guān)系，這也是檢驗(yàn)酶反應(yīng)和測(cè)定系統(tǒng)是否適宜、正確的標(biāo)準(zhǔn)。 醫(yī)學(xué)全在線網(wǎng)站gydjdsj.org.cn
要達(dá)到上述測(cè)定要求，最基本的是必須測(cè)定反應(yīng)初速度。圖可以很好地說(shuō)明二者的關(guān)系，（a）是在不同酶濃度條件下得到的反應(yīng)進(jìn)程曲線，可見(jiàn)酶濃度不同，反應(yīng)速度下降的先后、快慢各不相同；如果將這些曲線在不同時(shí)間測(cè)得的反應(yīng)速度相對(duì)酶濃度作圖，就可得到 （b）所示的酶濃度曲線，可見(jiàn)只有在反應(yīng)時(shí)間to測(cè)得的反應(yīng)速度和酶濃度間具有合乎要求的線性比例關(guān)系；而在t1和t2（t2〉t1＞to）得到的結(jié)果則不一定這樣，反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)，這種偏離也越大。
（圖13酶反應(yīng)進(jìn)程曲線與酶濃度曲線的關(guān)系）
所以在通常的酶活力測(cè)定時(shí)，總要先制備兩條曲線：酶反應(yīng)進(jìn)程曲線和酶濃度曲線。從前者求得反應(yīng)初速度，根據(jù)初速度繪制酶濃度曲線，并通過(guò)后者來(lái)檢驗(yàn)酶反應(yīng)測(cè)定系統(tǒng)是否適宜。
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