組織學(xué)與胚胎學(xué):二、組織學(xué)研究方法

（一)一般光學(xué)顯微鏡術(shù)

應(yīng)用一般光學(xué)顯微鏡（簡(jiǎn)稱光鏡)觀察組gydjdsj.org.cn/zhicheng/織切片是組織學(xué)研究的最基本方法。取動(dòng)物或人體的新鮮組織塊，先用固定劑（fixative)固定（fixation)，使組織中的蛋白質(zhì)迅速凝固，防止細(xì)胞自溶和組織腐敗。常用的固定劑如灑精、甲醛、醋酸、苦味酸、四氧化鋨等，一般常將幾種固定劑配制成混合固定液，以抵消或減弱單種固定劑對(duì)組織的收縮或膨脹等缺點(diǎn)，達(dá)到更好固定效果。固定后的組織塊（約3～5mm³大小)用石蠟、火棉膠或樹脂等包埋（embedding)成硬塊，以切片機(jī)（microtome)切成5～10μm厚的組織切片（tissue section)，切片貼在載玻片上經(jīng)脫蠟等步驟后進(jìn)行染色。組織塊也可立即投入液氮（－196℃)內(nèi)快速凍結(jié)，用恒冷箱切片機(jī)（cryostat)制成冷凍切片（frozen section)，這種方法制片迅速，細(xì)胞內(nèi)酶活性保存較好，常用于酶組織化學(xué)染色。血細(xì)胞和分離培養(yǎng)的細(xì)胞可直接涂在玻片上，制成涂片（smear)。疏松結(jié)締組織和腸系膜等軟組織可撕成薄片鋪在玻片上（鋪片)，牙和骨等堅(jiān)硬組織可磨成薄片（磨片)。組織切片等標(biāo)本經(jīng)染色、透明后，以封固劑和蓋片封固，即可長(zhǎng)期保存，鏡下觀察。

圖1－1　堅(jiān)牢綠（酸性染料)與亞甲藍(lán)（堿性染料)的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其染色反應(yīng)示意

染色（staining)是用染料使組織切片著色，便于鏡下觀察。天然和人工合成的染料甚多,它們都是含發(fā)色團(tuán)的有機(jī)化合物，當(dāng)染料具有助色團(tuán)成為鹽類物質(zhì)，即可溶解于水并具電荷，與組織有親合力，使組織著色。含氨基（－NH₂)、二甲氨基〔－N（CH₃)₂〕等堿性助色團(tuán)的染料，稱堿性染料（basic dye)，它的鹽溶液具陽電荷；含羧基（－COOH)、羥基（－OH)或磺基（－SO₃H)等酸性助色團(tuán)的染料，稱酸性染料（acid dye)，它的溶液具陰電荷（圖1－1)。組織的染色原理一般認(rèn)為基于化學(xué)結(jié)合或物理吸附作用。細(xì)胞和組織的酸性物質(zhì)或結(jié)構(gòu)與堿性染料親合力強(qiáng)者，稱嗜堿性（basophilia)；而堿性物質(zhì)或結(jié)構(gòu)與酸性染料親合力強(qiáng)者，稱嗜酸性（acidophilia)；若與兩種染料的親合力均不強(qiáng)者，稱中性(neutrophilia)。組織的基本成分是蛋白質(zhì)，構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸常是即有含氨基的，也有含羧基的，是兩性電解質(zhì)。各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)因氨基酸成分的不同而異，其電荷性質(zhì)又與溶液的pH值相關(guān)，根據(jù)研究目的選用合適的染色方法，調(diào)整好染液的pH值，即可取得良好染色效果。常用的酸性染料如伊紅、堅(jiān)牢綠、橙黃G等，堿性染料如蘇木精、亞甲藍(lán)、堿性品紅等。組織學(xué)中最常用的是蘇木精（hematoxylin)和伊紅（eosin)染色法，簡(jiǎn)稱HE染色法。蘇木精使細(xì)胞核和胞質(zhì)內(nèi)的嗜堿性物質(zhì)著藍(lán)紫色，伊紅使細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)和間質(zhì)內(nèi)的膠原纖維等著紅色。

物理吸附作用的染色方法，如用蘇丹染料顯示脂肪組織，染料溶于脂肪內(nèi)，使細(xì)胞內(nèi)的脂滴顯色。又如用硝酸銀、氯化金等重金屬鹽顯示細(xì)胞和組織的某些結(jié)構(gòu)，則是使金屬微粒附著在結(jié)構(gòu)表面而呈棕黑色或棕黃色。銀染法中有些組織結(jié)構(gòu)可直接使硝酸銀還原而顯示，稱此為親銀性（argentaffin)；有些結(jié)構(gòu)無直接還原作用，需加入還原劑方能顯色，則稱為嗜銀性（argyrophilia)。還有些組織成分如結(jié)締組織和軟骨基質(zhì)中的糖氨多糖，當(dāng)用甲苯胺藍(lán)（toluidine blue)等堿性染料染色后呈紫紅色，這種現(xiàn)象稱為異染性(metachromasia)，其原理可能是該染料在溶液中呈單體狀態(tài)時(shí)顯藍(lán)色，當(dāng)它與多陰離子的高分子物質(zhì)耦合后，染料分子聚合成多聚體而顯紅色（圖1－2)。還有些染色方法的原理至今還不清楚。

圖1－2 異染性示意圖

(二)幾種特殊顯微鏡的應(yīng)用

1．熒光顯微鏡 熒光顯微鏡（fluorescence microscope)是用來觀察標(biāo)本中的自發(fā)熒光物質(zhì)或以熒光素染色或標(biāo)記的細(xì)胞和結(jié)構(gòu)。熒光顯微鏡是以高壓汞燈產(chǎn)生的短波紫外線為光源，并配有激發(fā)、阻斷、吸熱和吸收紫外線等濾片系統(tǒng)，標(biāo)本中的熒光物質(zhì)在紫外線激發(fā)下產(chǎn)生各種顏色的熒光，借以研究該熒光物質(zhì)在細(xì)胞和組織內(nèi)的分布。組織中的自發(fā)性熒光物質(zhì)如神經(jīng)細(xì)胞和心肌細(xì)胞等內(nèi)的脂褐素呈棕黃色熒光，肝貯脂細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞內(nèi)的維生素A呈綠色熒光，某些神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞和神經(jīng)纖維內(nèi)的單胺類物質(zhì)（兒茶酚胺、5－羥色胺、組胺等)在甲醛作用下呈不同顏色的熒光，組織內(nèi)含有的奎寧、四環(huán)素等藥物也呈現(xiàn)一定的熒光。細(xì)胞內(nèi)的某些成分可與熒光素結(jié)合而顯熒光，如溴化乙錠與吖啶橙可與DNA綜合，進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)DNA含量測(cè)定。熒光顯微鏡更廣泛用于免疫細(xì)胞化學(xué)研究，即以異硫氰酸或羅丹明等熒光素標(biāo)記抗體（一抗或二抗)，用該標(biāo)記抗體直接或間接地與細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原結(jié)合，以檢測(cè)該抗原的存在與分布。

2．相差顯微鏡 相差顯微鏡（phase contrast microscope)是用于觀察組織培養(yǎng)中活細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的。活細(xì)胞無色透明，一般光鏡下不易分辨細(xì)胞輪廓及其結(jié)構(gòu)。相差顯微鏡的特點(diǎn)是將活細(xì)胞不同厚度及細(xì)胞內(nèi)各種結(jié)構(gòu)對(duì)光產(chǎn)生的不同折射作用，轉(zhuǎn)換為光密度差異（明暗差)，使鏡下結(jié)構(gòu)反差明顯，影像清楚。組織培養(yǎng)研究常用的是倒置相差顯微鏡（inverted phase contrast microscope)，它的光源和聚光器在載物臺(tái)的上方，物鏡在載物臺(tái)的下方，便于觀察貼附在培養(yǎng)器皿底壁上的活細(xì)胞。

3．暗視野顯微鏡 暗視野顯微鏡（dark-field microscope)主要用于觀察因反差或分辨力不足的微小顆粒。此種顯微鏡主要是有一個(gè)暗視野集光器，使光線不直接進(jìn)入物境，故呈暗視野。而標(biāo)本內(nèi)的小顆粒產(chǎn)生的衍射光或散射光進(jìn)入物鏡，暗視野中的顆粒呈明亮小點(diǎn)，如同在暗室可見一束光線中的微小塵粒一般。普通通光鏡最大分辨率為0.2μm，暗視野顯微鏡則可分辨0.004～0.2μm的微粒，適用于觀察細(xì)胞內(nèi)線粒體運(yùn)動(dòng)及標(biāo)本中細(xì)菌等微粒的運(yùn)動(dòng)等。

4．共集激光掃描顯微鏡 共焦激光掃描顯微鏡（confocal laser scanning microscope,CLSM)是近10年研制成的高光敏度、高分辨率的新型儀器。它以激光為光源，光束經(jīng)聚焦后落在樣品（組織厚片或細(xì)胞)不同深度的微小一點(diǎn)，并作移動(dòng)掃描，通過電信號(hào)彩色顯像，經(jīng)過微機(jī)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行二維和三維分析處理。CLSM可對(duì)細(xì)胞進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)圖像分析，細(xì)胞內(nèi)各種熒光標(biāo)記物的微量分析，細(xì)胞內(nèi)Ca²⁺、pH值等的動(dòng)態(tài)分析測(cè)定，細(xì)胞的受體移動(dòng)、膜電位變化、酶活性和物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的測(cè)定，并以激光對(duì)細(xì)胞及其染色體進(jìn)行切割、分離、篩選和克隆。因此，CLSM是一種高技術(shù)產(chǎn)品，可對(duì)細(xì)胞的多種功能進(jìn)行全自動(dòng)、高效、快速的微量定性和定量測(cè)定。

其他如偏光顯微鏡用于研究組織晶體物質(zhì)及纖維等的光學(xué)性質(zhì)，紫外光顯微鏡用于研究細(xì)胞內(nèi)核酸的分布與定量等。

（三)組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)術(shù)

組織化學(xué)（histochemistry)和細(xì)胞化學(xué)（cytochemistry)技術(shù)是通過化學(xué)或物理反應(yīng)原理顯示組織切片細(xì)胞內(nèi)某種化學(xué)成分，進(jìn)行定位、定量及其與功能相關(guān)的研究。如糖類、脂類、酶、核酸等與試劑發(fā)生化學(xué)物理反應(yīng)，形成有色終末產(chǎn)物，在光鏡下觀察，有的可在電鏡下觀察。

1．糖類顯示多糖和蛋白多糖的常用方法是過碘酸－雪夫反應(yīng)（periodic acid Schiff reaction,PAS反應(yīng))�；�本原理是過碘酸的氧化作用先使糖分子的乙二醇基變?yōu)橐叶�醛基，后者繼而與Schiff試劑（無色亞硫酸品紅復(fù)合物)結(jié)合，形成紫紅色反應(yīng)產(chǎn)物（圖1－3)。顏色反應(yīng)的深淺取決于組織內(nèi)多糖的乙二醇分子的多寡。

圖1－3 PAS反應(yīng)原理示意圖

2．脂類脂類物質(zhì)包括脂肪和類脂。標(biāo)本用甲醛固定，冷凍切片，脂類保存較好。多用蘇丹染料、油紅O、尼羅藍(lán)等溶于脂類的染料染色，使脂質(zhì)呈色。也可用四氧化鋨（O_SO₄)染色，脂肪酸或膽堿可使O_SO₄還原為O_SO₂而呈黑色。

3．酶細(xì)胞內(nèi)的酶種類甚多，有氧化還原酶、水解酶、合成酶、轉(zhuǎn)移酶等幾類，目前已有100多種酶組織化學(xué)染色法。酶組化反應(yīng)的基本原理是利用酶對(duì)其相應(yīng)底物的水解、氧化等作用，然后再使底物的反應(yīng)產(chǎn)物與某種捕獲劑發(fā)生反應(yīng)，形成沉淀或有色的最終產(chǎn)物，借此檢測(cè)該酶在組織切片或細(xì)胞內(nèi)的分布及活性強(qiáng)弱。如細(xì)胞的磷酸酶是一種重要的水解酶，堿性磷酸酶（ALP)和酸性磷酸酶（ACP)在合適的pH條件下可水解有機(jī)磷酸脂。小腸上皮細(xì)胞表面的紋狀緣和腎近曲小管表面的刷狀緣處，微絨毛含有豐富的ALP，與物質(zhì)的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)功能相關(guān)；許多細(xì)胞的溶酶體內(nèi)則含大量ACP，參與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)代謝。這兩種酶均可以β－甘油磷酸鈉為底物，底物被水解產(chǎn)生磷酸根，再以Ca²⁺、Co²⁺(顯示ALP)或Pb²⁺（顯示ACP)捕獲磷酸根，最后用硫化銨處理，即形成硫化鈷或硫化鉛黑色最終產(chǎn)物，出現(xiàn)在組織切片中該酶存在的部位。因此，酶組化染色不是酶本身的直接顯色，而是酶作用底物的化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)物顯色的。

4．核酸 顯示DNA的傳統(tǒng)方法是Feulgen反應(yīng)，切片先用稀鹽酸處理，使DNA分子中脫氧核糖與嘌呤之間的連接鍵打開，形成醛基，再與Schiff 試劑作用，原理同PAS反應(yīng)，使細(xì)胞核DNA顯紫紅色。還可用甲基綠－焦寧染色法同時(shí)顯示DNA和RNA，這兩種染料都是堿性，甲基綠使細(xì)胞核內(nèi)的DNA呈藍(lán)綠色，焦寧使細(xì)胞質(zhì)和核仁內(nèi)的RNA呈紅色。

圖1－4 免疫細(xì)胞化學(xué)術(shù)示意圖

圖1－5 人呼吸道分離上皮細(xì)胞粘蛋白免疫熒光像

（美國戴維斯加州大學(xué) 吳忍教授供圖)

（四)免疫細(xì)胞化學(xué)術(shù)

免疫細(xì)胞化學(xué)（immunocytochemistry)術(shù)是應(yīng)用抗原與抗體結(jié)合的免疫學(xué)原理，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)多肽、蛋白質(zhì)及膜表面抗原和受體等大分子物質(zhì)的存在與分布。這種方法特異性強(qiáng)，敏感度高，進(jìn)展迅速，應(yīng)用廣泛，成為生物學(xué)和醫(yī)學(xué)眾多學(xué)科的重要研究手段。近年隨著純化抗原和制備單克隆抗體的廣泛開展以及標(biāo)記技術(shù)不斷提高，免疫細(xì)胞化學(xué)的進(jìn)展更是日新月異，不僅用于許多基本理論的研究，并取得重大突破，而且也用于疾病的早期快速診斷等臨床實(shí)際。組織的多肽和蛋白質(zhì)種類繁多，具有抗原性。分離純化人或動(dòng)物組織某種蛋白質(zhì)，作為抗原注入另一種動(dòng)物體內(nèi)，后者即產(chǎn)生相應(yīng)的特異性抗體（免疫球蛋白)。從被免疫動(dòng)物的血清中提取出該抗體，再以熒光素、酶、鐵蛋白或膠體金標(biāo)記，用這種標(biāo)記抗體處理組織切片或細(xì)胞，標(biāo)記抗體即與細(xì)胞的相應(yīng)蛋白質(zhì)（抗原)發(fā)生特異性結(jié)合（圖1-4)。常用的熒光素是異硫氰酸熒光素（FITC)和四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC)，在熒光顯微鏡下可觀察熒光抗體抗原復(fù)合物（圖1－5)。常用的酶是辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP,從辣根菜中提取的)，它的底物是3，3^"－二氨基、聯(lián)苯胺（DAB)和H₂O₂,HRP使DAB氧化形成棕黃色產(chǎn)物，可在光鏡和電鏡下觀察（圖1－6)。鐵蛋白和膠體金標(biāo)記抗體與抗原的結(jié)合，也可在光鏡和電鏡下觀察（圖1－7)。

圖1－6 大鼠腺垂體免疫組織化學(xué)（PAS法)示生長(zhǎng)激素細(xì)胞

（上海醫(yī)科大趙培林教授供圖)

圖1-7 免疫細(xì)胞化學(xué)（蛋白A-膠體金法)和原位雜交術(shù)示大鼠垂體

催乳素細(xì)胞電鏡像 N催乳素細(xì)胞核

↑分泌顆粒內(nèi)顯示金粒

粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（RER)顯示銀粒

（加拿大Douglas醫(yī)院研究中心童毅愛博士贈(zèng)圖)

標(biāo)記抗體民被檢抗原的結(jié)合方式有兩種。一是直接法，即如上述用標(biāo)記抗體與樣品中的抗原直接結(jié)合（圖1－8)。這種方法操作簡(jiǎn)便，但敏感度不及間接法。間接法是將分離的抗體（第一抗體簡(jiǎn)稱一抗)再作為抗原免疫另一種動(dòng)物，制備該抗體（抗原)的抗體（第二抗體簡(jiǎn)稱二抗)，再以標(biāo)記物標(biāo)記二抗。先后以一抗和標(biāo)記二抗處理樣品，最終形成抗原一抗－標(biāo)記二抗復(fù)合物（圖1－8)。間接法中的一個(gè)抗原分子可通過一抗與多個(gè)標(biāo)記二抗相結(jié)合，因此它的敏感度較高，而且目前國內(nèi)外均有多種標(biāo)記二抗商品供應(yīng)，使用方便。間接法中較常用的是一種稱之為過氧化物酶－抗過氧化物酶復(fù)合物法（peroxidase-antiperoxidase complexmethod,PAS法)，該法除需一抗和二抗外，還需制備HRP標(biāo)記的抗酶抗體，即以HRP作為抗原免疫動(dòng)物，制成抗HRP抗體，再以HRP標(biāo)記該抗體制成由3個(gè)酶分子與2個(gè)抗酶抗體組成的相當(dāng)穩(wěn)定的環(huán)形PAP復(fù)合物。標(biāo)本先后以一抗、二抗和PAP復(fù)合物處理后，再以DAB顯色，即可檢測(cè)抗原的分布。此法由于細(xì)胞內(nèi)的抗原通過抗體的層層放大而與多個(gè)酶分子結(jié)合，因此敏感性很強(qiáng)（圖1－9)。

圖1－8 免疫細(xì)胞化學(xué)直接法（A)與間接法（B)示意圖

圖1－9 免疫細(xì)胞化學(xué)PAP法示意圖

免疫細(xì)胞化學(xué)術(shù)近10年來又有新進(jìn)展，如生物素－親合素等新穎試劑的應(yīng)用，為檢測(cè)微量抗原、受體、抗體開辟了新途徑。生物素（biotin)又稱維生素H，是從卵黃和肝中提取的一種小分子物質(zhì)（分子量244.31)；親合素（avidin)又稱卵白素，是從卵白中提取的一種糖蛋白（分子量68kD)。每個(gè)親合素分子有生物素結(jié)合的4個(gè)位點(diǎn)，二者可牢固結(jié)合成不可逆的復(fù)合物。生物素－親合素的應(yīng)用大致有三種方法。①標(biāo)記親合素－生物素法（labelled avidin- biotin method,LAB法)：將親合素與標(biāo)記物（HRP)結(jié)合，一個(gè)親合素可結(jié)合多個(gè)HRP；將生物素與抗體（一抗與二抗)結(jié)合，一個(gè)抗體分子可連接多個(gè)生物素分子，抗體的活性不受影響。細(xì)胞的抗原（或通過一抗)先與生物素化的抗體結(jié)合，繼而將標(biāo)記親合素結(jié)合在抗體的生物素上，如此多層放大提高了檢測(cè)抗原的敏感性（圖1－10)。②橋連親合素－生物素法（bridged avidin-biotin method,BAB法)：先使抗原與生物素化的抗體結(jié)合，再以游離親合素將生物素化的抗體與酶標(biāo)生物素搭橋連接，也達(dá)到多層放大效果（圖1－10)。③親合素－生物素－過氧化物酶復(fù)合物法（avidin-biotin-peroxidase complexmethod,ABC法)；此法是前兩種方法的改進(jìn)，即先按一定比例將親合素與酶標(biāo)生物素結(jié)合在一起，形成親合素－生物素－過氧化物酶復(fù)合物（ABC復(fù)合物)，標(biāo)本中的抗原先后與一抗、生物素化二抗、ABC復(fù)合物結(jié)合，最終形成晶格樣結(jié)構(gòu)的復(fù)合體，其中網(wǎng)絡(luò)了大量酶分子，從而大大提高了檢測(cè)抗原的靈敏度（圖1－10)�，F(xiàn)有配制現(xiàn)成的ABC藥盒商品供應(yīng)，操作簡(jiǎn)便，是目前廣泛應(yīng)用的一種方法。

圖1－10 生物素－親合素免疫細(xì)胞化學(xué)示意圖

（1)標(biāo)記親合素－生物素法

（2)橋連親合素－生物素法

（3)親合素－生物素－過氧化物酶復(fù)合物法（ABC法)

（五)同位素示蹤術(shù)

同位素示蹤術(shù)是用放射性核素的射線作用，研究細(xì)胞對(duì)某種物質(zhì)的吸收、合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌等代謝過程。將放射性核素或其標(biāo)記物注入動(dòng)物體內(nèi)或加入細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基內(nèi)，細(xì)胞攝取該物質(zhì)后，取被檢組織制成切片或細(xì)胞涂片。可用顯微鏡放射自顯影術(shù)（microau toradiography)檢測(cè)該放射性物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的原位分布及其代謝轉(zhuǎn)歸，即將薄層感光乳膠涂在切片或涂片的表面，標(biāo)本在暗盒內(nèi)保存一定時(shí)間后，細(xì)胞內(nèi)的放射性核素產(chǎn)生的射線使乳膠中的溴化銀還原為銀粒，經(jīng)顯影和定影后在光鏡下觀察銀粒的分布。β射線能量低，射程短，電離作用強(qiáng)，常用的β射線核素是³H、¹⁴C、³²P、³⁵S、⁴⁵Ca、¹³¹I。如用³H－胸腺嘧啶核苷研究細(xì)胞DNA合成及細(xì)胞增殖動(dòng)態(tài)（圖1－11)。用³⁵S－蛋氨酸研究某些腺細(xì)胞分泌物的合成與排泄，用¹³¹I－碘化鈉研究甲狀腺素的合成等。還可做標(biāo)本中的銀粒數(shù)計(jì)量或其光密度測(cè)定，進(jìn)行定量分析。另外，也可用液體閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)定分離細(xì)胞或其勻漿的放射線強(qiáng)度，進(jìn)行定量研究。

（六)原位雜交術(shù)

原位雜交術(shù)（in situ hybridization)是一種核酸分子雜交技術(shù)，它是通過檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)mRNA和DNA序列片段，原位研究細(xì)胞合成某種多肽或蛋白質(zhì)的基

圖1－11 大鼠肝大部切除后再生過程中增殖期肝細(xì)胞

攝取³H標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷放射自顯影像

↑ 增殖期肝細(xì)胞核

因表達(dá)。其基本原理是根據(jù)兩條單鏈核苷酸互補(bǔ)堿基序列專一配對(duì)的特點(diǎn)，應(yīng)用已知堿基序列并具有標(biāo)記物的RNA或DNA片段即核酸探針（probe)，與組織切片或細(xì)胞內(nèi)的待測(cè)核酸（RNA或DNA片段)進(jìn)行雜交，通過標(biāo)記物gydjdsj.org.cn/wsj/的顯示，在光鏡或電鏡下觀察目的mRNA或DNA的存在與定位。此項(xiàng)技術(shù)需首先制備某種核酸探針，其種類主要有三種：①利用大肝桿菌重組帶有目的基因的質(zhì)粒DNA，制成互補(bǔ)DNA探針(cDNA);②應(yīng)用限制性核酸內(nèi)切酶消化制成線性DNA模板，在體外轉(zhuǎn)錄獲得反意RNA探針(cDNA);③依照待測(cè)核酸的核苷酸序列，應(yīng)用DNA合成儀合成寡聚核苷酸探針。cRNA和cDNA的常用標(biāo)記物有³²S、³²P、³H等放射性核素和熒光素、生物素、地高辛等非放射性物質(zhì)。組織學(xué)應(yīng)用的原位雜交術(shù)主要是染色體原位雜交和細(xì)胞原位雜交。前者是研究遺傳基因、抗原基因、受體基因、癌基因等在染色體上的定位與表達(dá)；后者是研究細(xì)胞某種蛋白質(zhì)的基因轉(zhuǎn)錄物mRNA在胞質(zhì)內(nèi)的定位與表達(dá)（圖1－7，1－12)。核酸分子雜交術(shù)有很高的敏感性和特異性，它是免疫細(xì)胞化學(xué)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步從分子水平探討細(xì)胞功能的表達(dá)及其調(diào)節(jié)機(jī)制的，已成為當(dāng)前細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)研究的重要手段。

圖1－12 原位雜交術(shù)光鏡像

A ³²P標(biāo)記胰島素cRNA探針放射自顯影顯示大鼠胰島B細(xì)胞內(nèi)胰島素mRNa

B 地高辛－堿性磷酸酶標(biāo)記胰島素cRNA探針顯示大鼠胰島B細(xì)胞內(nèi)胰島素mRNA

C 地高辛－堿性磷酸酶標(biāo)記心鈉素cRNA探針顯色示體外培養(yǎng)的人胎兒臍靜脈

內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的心鈉素mRNA ×850

（第三軍醫(yī)大學(xué)蔡文教授供圖)

（七)細(xì)胞和細(xì)胞化學(xué)定量術(shù)

組織和細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及其化學(xué)成分的定量研究，是以量的測(cè)定及其數(shù)據(jù)變化闡述組織和細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、代謝和功能的演變以及對(duì)環(huán)境因素和致病因素的反應(yīng)。生命科學(xué)的研究不斷深入，定量技術(shù)的應(yīng)用日益廣泛并有所進(jìn)展。

1、顯微鏡分光亮度定量術(shù)此方法是應(yīng)用顯微分光亮度計(jì)（microspectrophotometer)測(cè)定組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)染色標(biāo)本的反應(yīng)強(qiáng)弱，進(jìn)行化成分的定量分析的。基本原理是細(xì)胞內(nèi)某種物質(zhì)的含量不同，其染色反應(yīng)的深淺不一，對(duì)一定波長(zhǎng)的光吸收也就不同，即某物質(zhì)的消亮度與一定厚度和面積內(nèi)的該物質(zhì)濃度成正比。通過光電組合自動(dòng)控制系統(tǒng)將消光度轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，即可得出光密度值（O、D值)，進(jìn)行定量分析比較。前述熒光素染色、酶和核酸組織化學(xué)染色、多肽和蛋白質(zhì)免疫組化染色、放射自顯影和原位雜交等標(biāo)本，均可應(yīng)用顯微分光光度計(jì)做定量分析。

2、形態(tài)計(jì)量術(shù) 形態(tài)計(jì)量術(shù)（morphometry)是運(yùn)用數(shù)學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)原理對(duì)組織和細(xì)胞進(jìn)行二維和三維的形態(tài)測(cè)量研究，如細(xì)胞及其微細(xì)結(jié)構(gòu)成分的數(shù)量、體積、表面積、周長(zhǎng)等的相對(duì)和絕對(duì)值的測(cè)量，其中三維立體結(jié)構(gòu)的研究又稱體視學(xué)（stereology)。機(jī)體組織的光鏡結(jié)構(gòu)計(jì)量已有不少有意義的資料，如人和動(dòng)物的肺泡數(shù)量和表面積，腎小體的數(shù)量和體積比，肝細(xì)胞的體積和數(shù)量，胰島的數(shù)量及各類細(xì)胞的數(shù)量比，腺垂體各種內(nèi)分泌細(xì)胞的數(shù)量比等。通過組織切片或照片（光鏡和電鏡)平面圖像的測(cè)量，推算其立體結(jié)構(gòu)數(shù)值，傳統(tǒng)方法是將測(cè)試系統(tǒng)（點(diǎn)、線、方格等)投影或覆蓋在切片上或照片上，把若干樣品的平面測(cè)量數(shù)據(jù)按數(shù)學(xué)公式推算出其立體數(shù)值。目前已廣泛應(yīng)用圖像分析儀（image analyzer)進(jìn)行形態(tài)計(jì)量研究，該儀器也是光學(xué)、電子學(xué)和計(jì)算機(jī)高技術(shù)產(chǎn)品，它是將切片或照片圖像通過攝像機(jī)顯示于監(jiān)示器屏幕上，并根據(jù)不同結(jié)構(gòu)的顏色深淺（灰度)及各像點(diǎn)的大小位置，快速準(zhǔn)確地得出所需的各種形態(tài)數(shù)據(jù)。組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)染色標(biāo)本，也可應(yīng)用圖像分析儀測(cè)定其光密度值，進(jìn)行定量分析。

3、流式細(xì)胞術(shù) 流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry,FCM)是近年建立的細(xì)胞分類和定量研究技術(shù)，它是應(yīng)用流式細(xì)胞儀（或稱熒光激活細(xì)胞分類器，fluroescent activated cell sorter)對(duì)單個(gè)細(xì)胞生物化學(xué)和生物物理特性進(jìn)行快速定量測(cè)定的。工作原理是先分離被檢細(xì)胞制成懸液，并作熒光染色或標(biāo)記，使單細(xì)胞液流快速通過該儀器的激光器照射分析區(qū)，被檢細(xì)胞產(chǎn)生的不同熒光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娒}沖，分別輸入計(jì)算機(jī)內(nèi)貯存，并顯示于示波器屏幕上，即可獲得該細(xì)胞群體中不同類型細(xì)胞的有關(guān)數(shù)據(jù)，如不同細(xì)胞的數(shù)量、熒光強(qiáng)度以及細(xì)胞體積、表面積和內(nèi)部結(jié)構(gòu)等參數(shù)；還可使細(xì)胞附有不同電荷，分類收集各種細(xì)胞，該技術(shù)的特點(diǎn)是速度快，精確性高，靈敏度大，已成為一種重要手段廣泛用于細(xì)胞動(dòng)力學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)等的研究。如細(xì)胞DNA，RNA或某種蛋白質(zhì)的含量分析，單個(gè)染色體DNA含量及分選，淋巴細(xì)胞膜抗原或受體的分析及細(xì)胞亞群分選，雜交細(xì)胞等的分選等，也用于腫瘤臨床診斷及療效和預(yù)后的分析等。

（八)電子顯微鏡術(shù)

1、透射電鏡術(shù) 透射電鏡（transmission electron microscope,TEM)是以電子束穿透樣品（組織的超薄切片)，經(jīng)聚合放大后，顯像于熒光屏上進(jìn)行觀察和攝片的。電鏡的放大倍數(shù)的分辨率比光鏡大得多，放大倍數(shù)為幾萬至幾十萬倍，分辨率可達(dá)0.2nm。標(biāo)本制備較光鏡的更嚴(yán)格，新鮮組織切成小塊（lmm³)，用戊二醛，多聚甲醛、四氧化鋨等固定，樹脂包埋，以超薄切片機(jī)切成厚50～80nm的超薄切片，經(jīng)醋酸鈾和檸檬酸鉛等重金屬電子染色后，置于電鏡下觀察，標(biāo)本在熒光屏上呈黑白反差的結(jié)構(gòu)影像。被重金屬浸染呈黑色的結(jié)構(gòu)，稱電子密度高（electron-dense)；反之，淺染的部分稱電子密度低（electron-lucent),這種染色稱正染色（positive staining)。若被染結(jié)構(gòu)著色淺淡，而其周圍部分染成黑,是稱為負(fù)染色（negative stainning)。透射電鏡的電子槍加速電壓50～100kV，電子束穿透力低，近年制成加速電壓500kV以上的超高壓電鏡，電子束穿透力很強(qiáng)，可觀察0.5～10μm厚的切片，可觀察細(xì)胞內(nèi)骨架等的立體超微結(jié)構(gòu)。應(yīng)用電鏡觀察細(xì)胞化學(xué)染色標(biāo)本，稱電鏡細(xì)胞化學(xué)術(shù)（electron microscope cytochemistry)；電鏡觀察免疫細(xì)胞化學(xué)染色標(biāo)本，稱免疫電鏡術(shù)（immunoelectron microscopy)；電鏡與放射自顯影結(jié)合的方法稱電鏡放射自顯影術(shù)（electron microscopeautoradiography)。

2、掃描電鏡術(shù) 掃描電鏡（scanning electron microscope,SEM)是用于觀察組織表面的立體結(jié)構(gòu)的。組織塊經(jīng)固定后，置于真空鍍膜儀內(nèi)于燥，在標(biāo)本表面先后噴鍍一層碳膜和合金膜，即可置于鏡下觀察。掃描電鏡的景深長(zhǎng)，樣品表面的金屬膜可提高其導(dǎo)電性和圖像反差，在熒光屏上掃描成像，呈現(xiàn)富有立體感的表面圖像，如細(xì)胞表面的突起、微絨毛、纖毛及細(xì)胞的分泌與吞噬行為等（圖1－13)。

圖1－13大鼠分離肝巨噬細(xì)胞粘著吞噬羊紅細(xì)胞掃描電鏡像

M肝巨噬細(xì)胞，R羊紅細(xì)胞

圖1－14 冷凍蝕刻標(biāo)本制備示意圖

圖1－15 細(xì)胞單位膜從中間層劈開示意圖

3、冷凍蝕刻復(fù)型術(shù)和冷凍割斷術(shù)

冷凍蝕刻復(fù)型術(shù)（tfeeze etch replica)：是在透射電鏡下觀察組織或細(xì)胞斷裂面的金屬復(fù)制膜，顯示細(xì)胞微細(xì)結(jié)構(gòu)的立體影像。組織塊先經(jīng)甘油生理鹽水處理（防止形成冰晶)后投入液氮快速冷凍，在低溫下用鋼刀將樣品劈開，形成凹凸不平的斷裂面：－100℃真空下使斷裂面的冰晶升華，暴露不平整表面；在斷裂面上先后噴鍍一層合金膜和碳膜，用次氯酸等組織腐蝕掉；將反差的凸凹不平的金屬復(fù)型膜置于鏡下觀察（圖1－14)。此項(xiàng)技術(shù)尤適用研究生物膜的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，如從單位膜的脂質(zhì)分子疏水端劈開（圖1－15)，經(jīng)蝕刻鍍膜，鏡下可見質(zhì)膜斷裂面復(fù)型膜結(jié)構(gòu)狀態(tài)（圖1－16)，其凹凸影像恰與實(shí)物相反。

圖1-16小鼠腎近曲小管微絨毛冷凍蝕刻復(fù)型電鏡像 ×38300

MV微絨毛 E E面，P P面（白求恩醫(yī)科大學(xué)尹昕、朱秀雄教授供圖)

冷凍割斷術(shù)（freeze cracking)：是將固定組織包埋在樹脂內(nèi)，低溫下割斷，斷面噴鍍合金，在掃描電鏡下觀察斷面的立體構(gòu)型。該技術(shù)適于研究組織內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)的相互關(guān)系，如肝細(xì)胞與肝血竇和膽小管的關(guān)系，腎小體的腎小囊與血管球的關(guān)系等（圖1－17)。

圖1－17 大鼠腎冷凍割斷掃描電鏡示腎小體

R腎小囊外表面，G血管球，T腎小管

（白求恩醫(yī)科大學(xué)尹昕、朱秀雄教授供圖)

4、電鏡X－射線顯微分析術(shù)X－射線顯微分析術(shù)（X-ray microanalysis)是研究細(xì)胞和組織內(nèi)元素的種類、分布和含量的新技術(shù)。它是利用高速電子束轟擊電鏡內(nèi)生物標(biāo)本的微小區(qū)域，使該區(qū)所含的元素發(fā)射了一定波長(zhǎng)的X－射線，通過檢測(cè)器對(duì)X－射線進(jìn)行波譜或能譜分析，即可測(cè)定微區(qū)內(nèi)元素的性質(zhì)、含量和分布。如測(cè)定細(xì)胞內(nèi)Na、K、Ca、Fe、P、Cl等及某些微量元素的含量和分布變化，探討各種元素與細(xì)胞生理和病理的關(guān)系。

（九)組織培養(yǎng)術(shù)

前述幾種方法都是取人體或在體（in vivo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的組織，經(jīng)固定等處理后，對(duì)已死亡的組織進(jìn)行觀察研究的。組織培養(yǎng)(tissue culture)或稱體外實(shí)驗(yàn)（in vitro)則是取活組織或活細(xì)胞在體外適宜的環(huán)境中培養(yǎng)成活，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。細(xì)胞在體外生存必須具有近似體內(nèi)的生存條件，如充足營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，合理的O₂與CO₂比例，必要的電解質(zhì)和適宜的滲透壓，pH值、溫度和濕度等，還需防止微生物污染。組織培養(yǎng)的特點(diǎn)在于可用研究各種理化因子（溫度、激素、藥物、毒物等)對(duì)活細(xì)胞的直接影響，并能觀察記錄（攝影、錄像)。組織培養(yǎng)與前述方法結(jié)合應(yīng)用，可研究某種因素對(duì)細(xì)胞增殖、分化、代謝、運(yùn)動(dòng)、吞噬、分泌等影響和調(diào)節(jié)的動(dòng)態(tài)過程，以及細(xì)胞病變、癌變和逆轉(zhuǎn)等機(jī)理，獲得在體實(shí)驗(yàn)難達(dá)到的研究目的。

組織培養(yǎng)用液為平衡鹽水及血清（小牛血清、胎盤血清等)，羊水、腹水、組織浸出液等天然培養(yǎng)基(natural medium)。天然培養(yǎng)基成分復(fù)雜，且不穩(wěn)定。目前廣泛應(yīng)用人工合成培養(yǎng)基（synthetic medium)現(xiàn)有多種商品供應(yīng)，使用方便，但常仍需補(bǔ)充部分血清等。若僅用合成培養(yǎng)基和已制備好的幾種必須因子與激素，稱此為無血清培養(yǎng)基（serum-free medium)，其成分和含量均是已知的，可精細(xì)研究某種因子對(duì)細(xì)胞的生物效應(yīng)。

組織培養(yǎng)的方法甚多，常用容器有凹玻片、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板、流動(dòng)小室等。取組織塊貼于瓶底進(jìn)行培養(yǎng)，可觀察從組織塊生長(zhǎng)遷移出的細(xì)胞。取胚胎某器官原基或器官的一部分進(jìn)行培養(yǎng)，稱器官培養(yǎng)（organ culture)。更精細(xì)的方法是分離和純化組織中的某種細(xì)胞，使之貼附在瓶底形成單層細(xì)胞（圖1－18)，稱此為細(xì)胞培養(yǎng)（cell culture)。首次培養(yǎng)的細(xì)胞，稱原代培養(yǎng)（primary cultrue；細(xì)胞增殖而密集再傳代培養(yǎng)，稱傳代培養(yǎng)（subculture)。經(jīng)長(zhǎng)期培養(yǎng)而成的細(xì)胞群體，稱細(xì)胞系（cell line)；用細(xì)胞克�。╟ell clone)或單細(xì)胞培養(yǎng)而建成的某種純細(xì)胞群體，稱細(xì)胞株（cell strain)。它們均可在液氮內(nèi)長(zhǎng)期凍存，供隨時(shí)應(yīng)用�，F(xiàn)已建成多種腫瘤細(xì)胞株，廣泛用于實(shí)驗(yàn)研究。

圖1－18 體外培養(yǎng)的上皮細(xì)胞在相差顯微鏡下的圖像（北京腫瘤研究所鄂征教授供圖)

（十)細(xì)胞融合術(shù)

2個(gè)或2個(gè)以上的細(xì)胞融合成為一個(gè)細(xì)胞，稱為細(xì)胞融合（cell fusion)。正常人體內(nèi)也有細(xì)胞融合現(xiàn)象，如兩性生殖細(xì)胞結(jié)合而成受精卵，多個(gè)巨噬細(xì)胞融合成一個(gè)體積很大的多核異物巨細(xì)胞。體外用人工方法使兩種細(xì)胞融合，制成一種新品系的雜交細(xì)胞（hybrid cell)，篩選出的此種雜交細(xì)胞有很強(qiáng)的生命力，增殖也很旺盛。常用的細(xì)胞融合誘導(dǎo)物是仙臺(tái)病毒（Sendai virus)和聚乙烯二醇（polythyleneglycol,PEG)。細(xì)胞融合術(shù)是細(xì)胞遺傳術(shù)、細(xì)胞免疫學(xué)、病毒學(xué)、腫瘤學(xué)等研究的一種重要手段，如將受抗原刺激后的小鼠脾淋巴細(xì)胞分離出來，與已建立的小鼠骨髓瘤（漿細(xì)胞瘤)細(xì)胞融合，篩選出的雜交瘤細(xì)胞可長(zhǎng)期存活和增殖，成為制備單克隆抗體的細(xì)胞株。