中國幽門螺桿菌研究:幽門螺桿菌感染診斷方法的進展

1983年從慢性活動性胃炎病人活檢標本中發(fā)現(xiàn)幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)以來，對Hp和Hp感染的研究進展神速�，F(xiàn)在已清楚Hp與許多種慢性胃病（B型胃炎，消化性潰瘍，胃癌等)關(guān)系密切，且成為它們重要的致病因子。目前臨床上為求得根治B型胃炎，消化性潰瘍等慢性胃病的療效，已越來越傾向于采用以抗Hp感染療法為主，再輔以其他對癥療法。因此如何正確考核抗Hp療效即成為一個重要問題，這就涉及到如何正確使用現(xiàn)有的各種診斷方法。本文擬對現(xiàn)有的Hp感染診斷方法作一介紹，以供不同的臨床條件合理選用。

作為一種理想的診斷方法當然應(yīng)有高度的敏感性和特異性，對病人僅有最小的侵襲性或者根本沒有損害性，操作簡單方便，僅需常規(guī)的技術(shù)和設(shè)備，費用也不太貴，易被病人所接受，無疑這樣理想的試驗仍然有待設(shè)計。盡管現(xiàn)有的各種方法還各有缺點，然而采用這些診斷方法已經(jīng)為弄清Hp感染的自然史及流行病學提供了大量信息�？磥恚�今后在準確診斷Hp感染，考核抗Hp療效和研制抗Hp的新藥等過程中仍需應(yīng)用這些診斷方法。

1　組織細胞學方法：

1.1　光鏡法

在Marshall和Warren的報告一、二個世紀之前已有人發(fā)現(xiàn)胃內(nèi)存在細菌，之所以一直未被重視是因為組織切片中所見的細菌往往是可疑的和多變的，事實上傳統(tǒng)的HE染色被認為證明Hp是不可靠的，因為在活檢標本中檢測Hp大大地受到所用染色法的種類和標本的采集兩方面因素影響。

Hp特征性的形態(tài)表現(xiàn)是3.0um×0.5um螺旋狀彎曲的細菌，定位于胃上皮細胞的表面或鄰近，迄今沒有一種所用的染色法是特異的（除非Mab染色)。一般染色法僅靠細菌的形態(tài)特征及定居部位判斷，常規(guī)使用的HE染色也可以籍此識別Hp感染者，但必需具有豐富經(jīng)驗。凡是未能在HE染色下見到時可以建議進一步用其它染色方法，例如用Warthin-Starry鍍銀染色，使它更為明顯。由于這一原因，鍍銀染色法盡管技術(shù)要求較高，費用較貴，還是得到較廣泛采用，價廉的常規(guī)應(yīng)用的Giemsa染色可獲得類似的效果，亞叮橙熒光染色也比較簡便有效，但需要有熒光顯微鏡，溴化乙錠，Gimenez和Hopps-Brown染色；相差顯微鏡；熒光抗體的免疫組織學方法也有人使用，但是似乎并不比常規(guī)使用的方法有更多優(yōu)點。

除了所有的染色方法外，第二個影響組織學檢驗Hp的因素是細菌在整個胃粘膜上分布的不均一性，特別是在胃體和噴門部位易出現(xiàn)斑片狀分布，雖然胃竇部位分布較均勻，一塊活檢標本仍有可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果。事實上每一塊不同來源活檢標本上可觀察到的細菌數(shù)有相當大的差異，一般認為，離幽門5cm部位至少采用兩塊活檢標本才能滿足診斷更求�；顧z標本作組織學檢查的另一個優(yōu)點是有機會同時去評估炎癥反應(yīng)的微觀證據(jù)，因為在肉眼觀察不存在粘膜異常時可能出現(xiàn)組織學胃炎，這一檢查可說明Hp的出現(xiàn)和炎癥之間的相關(guān)性。另外，沒有找到Hp的組織學慢性胃炎應(yīng)當小心的重復(fù)檢查切片以排除細菌感染。由此，胃活檢的組織學檢查能提供關(guān)于Hp的存在和胃粘膜病情相關(guān)的重要信息，雖然，需要作胃鏡檢查（有一定損傷性，患者多在不得以情況下接受這一檢查)是這一診斷方法上的障礙，但活檢標本在有臨床指征作胃鏡時是很容易獲得的。

1.2　電鏡法

可分透射電鏡和掃描電鏡兩種，而前者的超薄切片法對臨床診斷更有價值。①通過電鏡可觀察Hp的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征及與胃粘膜上皮細胞間的關(guān)系，更易確證Hp感染；②同時也可以觀察到胃上皮細菌表面和內(nèi)部的微細病理變化及與各類炎癥細胞間的關(guān)系。這一方法由于受到設(shè)備條件限制，可能更費時、費事、費錢，另外它也不可能避免Hp在胃粘膜上分布不均一性的影響。

2　微生物學方法

2.1　直接鏡檢法

這是一種簡便易行的方法。只要取一塊活檢標本在玻片上作涂片，經(jīng)革蘭染色，即可在油鏡下觀察，由于革蘭染色為一細菌鑒別染色法，放大倍數(shù)較組織學方法常用倍數(shù)為大，細菌形狀特征較明顯，因此，準確性較高。

2.2　快速尿素酶試驗

構(gòu)成幾種診斷Hp感染試驗基礎(chǔ)的一個重要特征是這個細菌產(chǎn)生尿素酶的能力特別強。尿素酶降解尿素成氨與CO₂，使周圍培養(yǎng)基pH升高，因此活檢標本中的Hp能籍pH指示劑顯色而檢測到，最早檢測Hp的尿素酶試驗采用Christensen2％尿素肉湯，它是一種標準的微生物學試劑，用于尿素酶產(chǎn)物的測定，在這個理論基礎(chǔ)上已發(fā)展了許多變化，范圍從自已能配制的尿、酚紅指示劑水溶液到商品化的CLOTest試劑盒等。目前常用的快速尿素酶制劑通常在活檢標本放入后幾分鐘內(nèi)即可顯示，?

■［此處缺少一些內(nèi)容］■

化酶（＋)，進一步可用種特異的單克隆抗體免疫斑點染色作檢定。另一個需要注意的問題是Hp活檢標本長期暴露在大氣中易死亡，因此應(yīng)即時臨床接種或?qū)�標本存放于運輸培養(yǎng)液中運送，及時送檢。

與組織學檢驗方法一樣，Hp的不均勻分布可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果，從理論上講，這似利不應(yīng)成為問題，因為一個活菌即能形成一個菌落，實際上因為菌落非常細小，或因被雜菌遮蓋，很難絕對避免疏忽遺漏，其他涉及Hp分離培養(yǎng)有成功的因素還可能包括：患者近期應(yīng)用了抗生素；作胃鏡檢查時攝入了局部麻醉藥；活檢鉗污染了雜菌或戊二醛等。

當前在治療慢性胃炎、消化性潰瘍等慢性胃病以抗菌療法為主的形勢下，為了幫助選擇合適的抗Hp藥物，需做藥敏試驗，通過培養(yǎng)方法獲得患者自身菌株是任何其他方法所不能取代的。Etest的出現(xiàn)簡化了原先MIC測定的步驟。

上述三種微生物學檢查方法可以說是各種其他檢查方法的基礎(chǔ)，在每發(fā)展一種新方法常需以之對照，尤其是直接涂片鏡檢和分離培養(yǎng)，因此有人曾稱之為“金標準”。

3　同位素示蹤方法

這一類方法主要是利用讓患者口服同位素標記的尿素，以觀察胃中Hp分解尿素的能力，籍此判斷患者是否感了Hp及其感染的程度，這類試驗現(xiàn)有兩類三種。

3.1　呼氣試驗

這一類試驗首先是Graham根據(jù)上述道理設(shè)gydjdsj.org.cn/zhicheng/計，于1987年首次報道的。他用的是穩(wěn)定性同位素¹³C標記的尿素，讓患者口服后，尿素在胃中接觸Hp的尿素酶后分俀成¹³CO₂，測定其在CO₂總呼出量中所占的濃度，以判斷胃中是否感染了Hp和感染的程度。這一種方法的最大優(yōu)點是：①體內(nèi)測定胃內(nèi)感染Hp的總體情況，避免了活檢標本Hp分布不均造成的假陰性的結(jié)果；②¹³C是一種穩(wěn)定性同位素，所以對機體是完全無損傷性的；③它除了定性以外，還可做定量測定。它的最大弱點是需用氣體同位素質(zhì)譜儀測定，這種設(shè)備是一般醫(yī)院內(nèi)不具備的貴重儀器，再加上¹³C是稀有元素，因此測試費用較貴。后來Bell設(shè)計了用¹⁴C標記的尿素讓患者口服，用閃爍掃描儀測定患者呼出的¹⁴CO₂，這種儀器在有核醫(yī)學科的醫(yī)院中一般都有，因此在醫(yī)院中測定較方便。但是¹⁴C是一種放性同位素，盡管它的價格不是太貴，射線也不是太強，但它的半衰期有5000⁺a，一旦被機體攝入，有可能對機體造成慢性的長期的內(nèi)照射損傷，因此這試驗對孕婦有小孩特別不宜使用，盡管它的優(yōu)點類同于¹³CO₂呼氣試驗，即使對成人亦應(yīng)慎重使用。

3.2　15N-尿素排出試驗

這一試驗是我國吳繼宗等人利用類似的原理在國際上首創(chuàng)的，其方法是用¹⁵N標記的尿素供患者口服，然后收集2h尿檢出其¹⁵N－尿氨的排出率，以判斷胃內(nèi)Hp感染程度。這一試驗具有¹³CO₂呼氣試驗同樣的優(yōu)點gydjdsj.org.cn/zhuyuan/，它是無損傷性的，不需作胃鏡，亦無放射性損傷；它是無損傷性的，不需作胃鏡，亦無放射性損傷；它的敏感性特異性高，是定量的，且是反映整個胃的感染情況，克服了活檢標本采樣有損傷性和分布不均的缺點，采樣比呼氣試驗方便，測定的準確性較高，缺點與¹³C－呼氣試驗相同，檢測需用質(zhì)譜儀，檢測費用較高，但是¹⁵N－尿素比¹³C－尿素要便宜得多，且有國產(chǎn)的，因此在必要時仍然是一種可以推廣使用的方法。例如：孕婦、小孩、老年人需要診斷Hp感染但不宜作胃鏡或是¹⁴C－呼氣試驗檢查時；為了鑒定一種抗Hp藥物究竟有沒有體內(nèi)療效及沒有胃病主訴但需要發(fā)解有無Hp感染的人等等。近年來對功能性胃消化不良究竟是否與Hp感染有關(guān)，臨床上爭論不休，可能¹⁵N－尿氨排出試驗是研究這一問題的最好方法之一¹²。由于¹⁵N－尿氨排出試驗是一種尿素在胃內(nèi)分解后，¹⁵N經(jīng)吸收通過腎臟由尿排出的試驗，因此有嚴重肝腎功能損害者不宜使用。

4　血清學方法

Hp相關(guān)的慢性胃炎能引起對Hp的局部和全身性免疫反應(yīng)。這一反應(yīng)構(gòu)成了特異性地鑒定胃活檢標本中的Hp（例如用單克隆抗體)和企圖用血清學方法診斷和評價療效的努力的基礎(chǔ)。雖然對研究了解Hp感染體液免疫反應(yīng)有了一些進展，但對后者目標的成功是有限的。

胃活檢中Hp陽性的病人中，IgG和IgA對Hp整菌混合抗原的抗體滴度高于活檢陰性病人，IgM抗體在Hp陽性和陰性個體間無明顯差別。大量工作表明，ELISA比細菌凝集反應(yīng)或補體結(jié)合反應(yīng)檢測Hp抗體更敏感。因此，IgG和IgA　ELISA是目前通常采用的方法。同時測定兩種免疫球蛋白能提高這一方法的敏銳性�；�于整菌混合抗原的ELISA與含有空腸彎曲菌的抗原有交叉反應(yīng)，因此許多學者都在積極努力用各種方法提取Hp的高特異性的抗原。有報告認為，用Hp的尿素酶作抗原可使ELISA的敏感性和特異性分別達到98.7％和100％。Pronovost等用Hp外膜蛋白提取的種特異性抗原，設(shè)計了一種快速的滲濾膜酶免疫試驗取代了ELISA試驗，其敏感性為94％，特異性＞99％，這種類型的試劑國內(nèi)亦已有人在研制。在未治療的Hp患者中，抗體水平提高的，且可隨著時間的推移而逐步升高，Hp根除后，抗體水平可逐漸下降，但是，需要長期隨訪，才能最后斷定下降的程度，為此，抗體滴度不適于用作監(jiān)測抗Hp療效的手段。唾液是一種體液，也曾用于Hp抗體的檢測，收集唾液是無侵襲性的，相當方便適用于大多數(shù)病人，包括兒童，雖然唾液抗體的出現(xiàn)與血清中的測量大致相當，但是有關(guān)唾液試驗的方法學問題以及采集無污染唾液的困難程度阻礙了唾液抗滴度作為一種診斷試驗在臨床上的廣泛采用。

由于Hp感染的自然清除是罕見的，因此一般可以假定血清學試驗陽性表明現(xiàn)時有感染，除非已采用了抗Hp療法，血清學方法簡便，成本較低，患者對采血的這一點侵襲性遠比做胃鏡檢查樂意接收，因此在一定條件下仍有它的使用價值。

5　分子生物學方法

多聚酶鏈反應(yīng)　多聚酶鏈反應(yīng)（Poly-merasechain reaction，PCR)實際上是一種核酸片段體外擴增試驗。做這一試驗的先決條件是首先必須弄清楚某一基因的核苷酸序列然后人工合成其中兩個特異性處段（其長度以15—30個堿基為宜，不宜過短或過長)作為引物，在PCR儀中經(jīng)過30—50個溫度循環(huán)擴增其核酸片段，使其呈幾何級數(shù)長，然后取其產(chǎn)生或其酶切片段在瓊脂糖上跑電泳，即可判斷所得產(chǎn)物是否即企望的基因產(chǎn)物。目前亦已可用這一反應(yīng)來測知標本中有無Hp的存在，甚至還可進一步用核苷酸序列分析或特異性探針加以鑒定。關(guān)于Hp的PCR根據(jù)所選引物的不同已經(jīng)有許多種，已知的這些引特主要來自Hp的尿素酶基因（UreA，UreB，UreC，UreD)，16SrRNA和編碼26KDa蛋白質(zhì)的核苷酸序列，縱觀不同學者所選用的引物，現(xiàn)在都能特異地以Hp有關(guān)基因作模板，擴增出部分核苷酸序列，而不引導(dǎo)擴增了其他細菌核苷酸序列。因此對Hp檢測的特異性和敏感性均較高，目前已開始用于各種臨床標本（活檢、胃液、牙菌斑等)的檢測和某些動物胃標本的檢測，有人還用PCR擴增后所得的DNA產(chǎn)物，以核酸內(nèi)切作指紋圖譜分析，用于Hp的流行病學研究。隨著PCR的發(fā)展，Williums等在這一基礎(chǔ)上又發(fā)展出了RAPD（Randmoamplified polymorphic DNA)技術(shù)或稱AP(arbitrary primer)—PCR。它的原理是采用隨機選出的單一核苷酸鏈為引物以靶DNA模板在多個部位引導(dǎo)擴增DNA。經(jīng)過RADP技術(shù)處理的結(jié)果可顯示出不同Hp株的特異性。因此亦有人把此方法用于Hp的流行病學研究上。隨著分子生物學技術(shù)的不斷發(fā)展，PCR技術(shù)的應(yīng)用在Hp的研究中很有前途，它反應(yīng)快，標本運輸條件要求不高，甚至可以郵寄，可是PCR的高敏感性也可能是它致命的弱點：使用試劑的濃度，操作的溫度，過度的擴增，極少DNA的污染等都可導(dǎo)致假陽性，因此嚴格控制件，合理選擇DNA擴增循環(huán)次數(shù)，謹防污染仔細設(shè)置對照等都是不可忽視的因素。

總之，Hp感染有許多方法檢查，最簡便的，成本最低廉的，僅有極小侵襲性的是血清學方法�？墒�，血清學陽性只能說曾感染過或現(xiàn)在正在感染，¹³C(20)和¹⁵N(21)同位素示蹤方法是完全無損傷性的，且能檢測即時使整個胃的感染情況。因此是比較理想的。可是由于受設(shè)備限制，費用較貴難于普遍推廣，¹⁴C同位素示蹤法雖然大醫(yī)院有條件可做，價格比¹³C，¹⁵N便宜，但有放射性損害，內(nèi)窺鏡檢查取活檢標本是侵襲性的，可作微生物學的直接檢查，同時可以觀察組織學變化，亦可為分子生物學檢查提供材料，若欲簡單一些，可以只做快速尿素酶試驗，最后，從活檢標本分離培養(yǎng)Hp，雖然因驗一些，但對選擇合適的抗Hp治療方案是必備條件。