中國(guó)幽門(mén)螺桿菌研究:抗幽門(mén)螺桿菌單克隆抗體的制備和臨床應(yīng)用

Marshall等于1983年首次從胃粘膜組織中分離到幽門(mén)螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp)，并報(bào)道和B型胃炎及消化性潰瘍密切相關(guān)。目前鑒定和診斷Hp感染有許多方法，但受種種因素制約，但結(jié)果受到一定影響。目前制備抗Hp單克隆抗體（Hp－mAb)的資料不多，Hp－mAb免疫過(guò)氧化物酶染色檢測(cè)胃粘膜活檢標(biāo)本，國(guó)內(nèi)未見(jiàn)報(bào)道。我們成功地制備了Hp－mAb，對(duì)其特性進(jìn)行了一系列鑒定，并應(yīng)用于臨床檢測(cè)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料和方法

1.1　Hp－mAb的制備

Hp109菌株系上海二醫(yī)大微生物教研室生慢性胃炎病人分離而得，經(jīng)系經(jīng)生物學(xué)狀鑒定。細(xì)菌微需氧培養(yǎng)后用生理鹽水洗下菌苔，洗滌3次，56℃30min滅活，1×10⁸CFU/ml濃度0.5ml，免疫Balb/c小鼠.每隔10d以同樣濃度劑量增強(qiáng)免疫，共2次。末次免疫后10d斷尾取血，gydjdsj.org.cn/zhuyuan/用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA)測(cè)定抗體效價(jià)。其效價(jià)大于1：1024，再以1×10⁸CFU/ml濃度0.5ml，加強(qiáng)免疫一次。第三天后取致敏Balb/c小鼠細(xì)胞與SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞用PEG作融合。經(jīng)ELISA篩選后，選擇分泌高滴度抗體的雜交瘤細(xì)胞，以有限稀釋法作克隆共4次。取雜交瘤細(xì)胞腹腔注入Balb/c小鼠，2周后收集腹水，離心（1500g)10min，去除細(xì)胞沉淀及脂肪，其腹水為Hp－mAb。ELISA篩選，Hp109超聲粉碎抗原2.5μg/μl包板；加50μl克隆細(xì)胞上清液，再加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗鼠IgG（1：1000稀釋)，于酶標(biāo)儀490nm處讀取吸光度值。

1.2　Hp－mAb特性鑒定

抗體類(lèi)別及亞類(lèi)鑒定無(wú)血清雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液與抗小鼠各類(lèi)免疫球蛋白及其亞類(lèi)IgA，IgM，IgG1，IgG2，IgG3，IgG2a，IgG2b（Miles LabInc，USA)作免疫雙擴(kuò)散試驗(yàn)。①聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE)：Hp109，Hp152，H99，Hp82，空腸彎曲菌（CJ)3276，結(jié)腸彎曲菌（CC)3276超聲粉碎抗原，稀釋至2mg/ml。加樣15ul；分離膠濃度10％；15mA恒流；以低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白（17500－94000)作標(biāo)準(zhǔn)，考馬氏亮監(jiān)R25染色。②免疫印跡法：Hp109超聲粉碎抗原，經(jīng)SDS－PAGE后電轉(zhuǎn)移至混合纖維濾膜上，電流450mA，7h，洗滌后加Hp－mAb腹水（1：50稀釋)室溫振蕩過(guò)夜。洗滌后加辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記兔抗鼠IgG（1：200稀釋)，室溫振蕩2h。洗滌后用二氨基聯(lián)苯胺（DAB)顯色。蒸餾水沖洗終止反應(yīng)。

1.3　敏感性鑒定

取18株常規(guī)鑒定為Hp菌株，細(xì)菌懸液涂片，丙酮固定60min后加Hp－mAbSCH9（1：100稀釋)，過(guò)夜。洗滌后加辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記兔抗鼠IgG（1：250稀釋)，室溫1h，洗滌后二氨基聯(lián)苯顯色。蒸餾水沖洗終止反應(yīng)。結(jié)果判斷：（－)Hp未染色；（＋)Hp淡棕色；（++)Hp深棕色；（+++)Hp棕黑色。以（++)以上為陽(yáng)性。

1.4　特異性鑒定

選擇15種常見(jiàn)腸道標(biāo)準(zhǔn)菌株作免疫過(guò)氧化物酶染色，方法同前，所用菌種如下。CJ3276和CC3278由法國(guó)Bordeaux兒童醫(yī)院Megraud博士惠贈(zèng)。鼠傷寒沙門(mén)菌50013，傷寒沙門(mén)菌50097，福氏志賀菌51574，產(chǎn)氣腸桿菌45102，小腸結(jié)腸耶爾森菌Y106，副溶血性弧菌20549，蜂窩哈夫尼亞菌45201，糞堿桿菌40001，司徒氏普羅威登斯菌420020，普通變形桿菌49102，弗勞地枸櫞酸桿菌48107，粘質(zhì)沙雷氏菌41002，大腸桿菌69－84由上海衛(wèi)生防疫站提供。

1.5　Hp－mAb初步應(yīng)用

從Hp陽(yáng)生治療后復(fù)查病人胃竇部取2塊胃粘膜活檢標(biāo)本，同時(shí)做培養(yǎng)，涂片Gram染色和Hp－mAbSCH9免疫過(guò)氧化物酶染色。

2　結(jié)果

2.1　雜交瘤細(xì)胞株建立

本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合率為66.7％（193/288)，其中分泌抗體孔率為37.5％（72/192)，經(jīng)篩選獲得3株Hp－mAb雜交瘤細(xì)胞株（SCH7，SCH9和SCH10)，接種小鼠腹腔后獲得腹水效價(jià)，列于表1。

表1　三株Hp－mAb性質(zhì)類(lèi)別

2.2　Hp－mAb特性鑒定

①抗體類(lèi)別及亞類(lèi)鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。②與Hp－mAb相應(yīng)的Hp抗原分子量的鑒定結(jié)果：Hp不同株之間菌體蛋白條帶相似，其7條主要菌體蛋白為71000，62000，58000，52000，29000，22000，12000。CJ和CC菌體蛋白相似，與Hp明顯不同，缺乏5800條帶。免疫印跡法3Hp－mAb均與Hp菌體蛋白58000條帶反應(yīng)。

2.3　敏感性鑒定結(jié)果

Hp－mAb SCH9與18株Hp菌株反應(yīng)均陽(yáng)性。Hp被染成深棕色或棕黑色，染色反應(yīng)均強(qiáng)于（++)，染色程度無(wú)明顯差異。

2.4　特異性鑒定

Hp－mAb SCH9與15株常見(jiàn)腸道標(biāo)準(zhǔn)菌株反應(yīng)均陰性，未出現(xiàn)（＋)以上的染色反應(yīng)。

2.5　Hp－mAb初步應(yīng)用

Hp－mAb SCH9免疫過(guò)氧化物酶染色檢測(cè)胃粘膜活檢標(biāo)本，結(jié)果列于表2。Hp被特異染成深棕色。Hp－mAb陽(yáng)生率高于培養(yǎng)和/或涂片Gram染色，兩種檢測(cè)方法差異有顯著性（P＜0.05)。

表2　不同方法檢測(cè)Hp比較

3　討論

有關(guān)Hp－mAb，目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道不多。制備Hp－mAb時(shí)，所用的免疫小鼠抗原有整菌抗原、超聲粉碎抗原或酸提取抗原。我們采用Hp整菌免疫Balb/c小鼠，細(xì)胞融合后經(jīng)篩選，得到3株高效價(jià)分泌Hp－mAb雜交瘤細(xì)胞株。

由于用Hp粗制抗原免疫小鼠，故各學(xué)者得到的Hp－mAb與Hp菌體蛋白反應(yīng)的條帶有差異。Engstrand等報(bào)道Hp－mAb與Hp25000菌體蛋白反應(yīng)。我們用SDS－PAGE分析Hp，發(fā)現(xiàn)其不同株之間菌體蛋白相似，有7條主要蛋白條帶。免疫印跡法發(fā)現(xiàn)3株Hp－mAb主要與其中5800菌株蛋白反應(yīng)，與杉山敏郎報(bào)道一致，而CJ和CC菌體蛋白中不存在這一條帶。困此可認(rèn)為Hp58000菌體蛋白有較強(qiáng)免疫原性和特異性。我們制備的Hp－mAb SCH9與18株Hp反應(yīng)陽(yáng)性，與CJ和CC及其它常見(jiàn)腸道標(biāo)準(zhǔn)菌株反應(yīng)陰性。結(jié)果表明敏感性好，特異性高，可以作為臨床診斷或鑒定細(xì)菌用試劑。Hp－mAb免疫過(guò)氧化物酶染色操作簡(jiǎn)單，光鏡可觀察。與常規(guī)分離培養(yǎng)和/或涂片G染色比較，后者陽(yáng)性標(biāo)本前者全部陽(yáng)性，另有7例分離培養(yǎng)和或涂片Gram染色陰性標(biāo)本，Hp－mAb免疫過(guò)氧化物酸染色發(fā)現(xiàn)有少量Hp。結(jié)查表明兩種檢測(cè)方法差異有顯著性（P＜0.05)。這種差異可能是由于Hp－mAb免疫過(guò)氧過(guò)物酶染色法Hp被特異地染成深棕色或棕黑色，背景淡，對(duì)比度好易于觀察。因此，分離培養(yǎng)法與活檢標(biāo)本涂片Gram染色法實(shí)際檢出效果可能還不及單純用Hp－mAb免疫過(guò)氧化物酶染色法。