膠體金標記蛋白質的原理，一般認為是由于pH值等于或稍偏堿于蛋白質等電點時，蛋白質呈電中性，此時蛋白質分子與膠體金顆粒相互間的靜電作用較小，但蛋白質分子的表面張力卻最大，處于一種微弱的水化狀態(tài)，較易吸附于金顆粒的表面，由于蛋白質分子牢固地結合在金顆粒的表面，形成一個蛋白層，阻止了膠體金顆粒的相互接觸，而使膠體金處于穩(wěn)定狀態(tài)，如果＝低于蛋白質的等電點時，蛋白質帶正電荷，膠體金帶負電荷，二者極易靜電結合形成大的聚合物。如果pH高于蛋白質等電點時，蛋白質帶負電荷，與金顆粒的負電荷相互排斥而不能互相結合。為防止蛋白質與膠體金的聚合與沉淀，常用牛血清白蛋白，卵白蛋白，聚乙二醇或明膠作穩(wěn)定劑。用Sephacryb S—400 （丙烯葡聚糖S—400)層析分離純化膠體金蛋白標記物只適用于以BSA作穩(wěn)定劑者。
（1)透析除鹽：蛋白質溶液內應除去多余的電解質，不然過高的鹽類物質會降低膠體金顆粒的Zeta電位，影響蛋白質的吸附，因此，標記之前必須徹底除鹽。一般將蛋白質置入透析袋中然后直接放入雙蒸水或極低濃度的gydjdsj.org.cn/rencai/鹽水（0.005mol/l NaCl , pH7.0)透析。
（2)去除蛋白質中的沉淀：長期低溫保存的蛋白質或4℃較長時間保存的抗體，特別是在濃度高于2mg/ml的情況下，很容易形成聚合物，聚合物對標記過程及免疫金探針的穩(wěn)定性有一定影響，因此，標記之前須離心以除去這些聚合物。一般以100000r/min 4℃離心60min取上清液，調整蛋白質濃度至1mg./ml即可用于標記。
膠體金與蛋白質的結合成功與否，取決于pH值，一般只有在蛋白質等電點（PI)略偏堿的條件下二者才能牢固地結合，因此，標記之前須將膠體金溶液的pH值調至待標記蛋白質的等電點略偏堿。需要提高膠體金的pH值時可用0.1molK2CO3，需要降低膠體金的pH值時可用0.1n HCl。測定金溶液的pH可能損害pH測定計的探頭，因此，一般用精密的pH試紙測定其pH即可。
幾種常用的蛋白質標記時膠體金所用的pH值見表5-4。
表5-4 常用幾種蛋白質標記時膠體金所用的pH值如下
| 蛋白質 | pH |
| 抗體（γ球蛋白) | 9.0 |
| 親合層析的IgG | 7.6 |
| 單克隆抗體 | 8.2 |
| F（ab＇)2 | 7.2 |
| SPA(葡萄球菌蛋白) | 6.0 |
| 蓖麻子植物凝血素Ⅰ | 8.0 |
| 蓖麻子植物凝血素Ⅱ | 8.0 |
| 花生凝集素 | 6.3 |
| Helix pomatia lectin | 7.4 |
| 大豆凝集素 | 6.1 |
| Lens Culinaris lectin | 6.9 |
| Lotus Tetragonolobus lectin | 6.3 |
| 荊豆凝集素 | 6.3 |
| Bandeirae simplicifolia lectin | 6.2 |
| 過氧化物酶 | 8.0 |
| 類卵粘蛋白 | 4.8 |
| 血漿銅蘭蛋白 | 7.0 |
| α-胎球蛋白 | 6.5 |
| 小牛血清白蛋白 | 6.5 |
| 牛血清白蛋白 | 5.5 |
| 牛血球白蛋白結合肽 | 4.5 |
| 牛血清白蛋白結合胰島素 | 5.3 |
| 霍亂毒素 | 6.9 |
| 破傷風毒素 | 6.9 |
| DNAase | 6.0 |
| RNAase | 9.0 |
| 低密度脂蛋白 | 5.5 |
| α2-巨球蛋白 | 6.0 |
| 抗生物素蛋白（親合素) | 10.0 |
| 鏈霉抗生物素蛋白 | 6.6 |
| 麥胚凝集素 | 9.9 |
（1)光電比色法：制備一系列不同濃度的等體積蛋白質溶液（1ml)，分別加入5ml膠體金中，迅速混勻，然后，各加入1ml 10% NaCl溶液，搖勻，靜置5min后測各管。根據膠體金顆粒的大小，OD在520～580nm之間測定，以OD值為縱坐標，蛋白質用量為橫坐標作一曲線，取曲線最先與橫軸相接近的那一點處的蛋白質用量為最適穩(wěn)定量。圖5.2中10nm的膠體金溶液中蛋白質的最www.med126.com適穩(wěn)定量為45μg/ml。
.jpg)
圖5-2 蛋白最適穩(wěn)定量示意圖
（2)目測法：以目測法確定膠體金與待標記蛋白質用量比例，將標記的蛋白質逐級稀釋后（由5μg～45μg另設對照管)，各取等體積順序加入一系列裝有1ml膠體金的試管中，5min后，在上述各管內分別加入0.1ml 10%氯化鈉，依表5-5順序進行。
表5-5 具體的做法是按表內進行
| 管數 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| 膠體金（ml) | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 蛋白質（μg) | 5 | 10 | 15 | 20 | 25 | 30 | 35 | 40 | 45 | 0 |
| 10%NaCl(ml) | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 |
①當分別加入0.1ml 10%氯化鈉后、混勻靜置2h以上觀察結果。
②沒有加入蛋白質的管為對照管。
③小于5nm顆粒的膠體金溶液，每個管內應加入5μl33%的雙氧水，否則有不變藍色及聚沉現象。未加蛋白及加入蛋白量不足以穩(wěn)定膠體金的試管，即呈現由紅變藍的聚沉現象，而加入蛋白量達到或超過最低穩(wěn)定量的試管則膠體金的紅顏色不變。其中含蛋白量最低的試管即含穩(wěn)定1ml膠體金的必須蛋白量。在此基礎上再加上20%即為穩(wěn)定所需蛋白質的實際用量。
當蛋白質的最適穩(wěn)定量及標記的最佳pH值被確定以后便可進行標記。具體步驟如下：
（1)根據用以標記的膠體金的總量計算出所需要的待標記蛋白質的總量。
（2)在電磁攪拌下，將蛋白質溶液加入膠體金溶液中（pH已調至PI超過0.5pH)，加入蛋白質時應逐滴加入，1mg的蛋白質大約5min加完。
（3)在磁性攪拌下加入5%的牛血清白蛋白（BSA)使其終濃度為1%，或加入3%聚乙二醇（PEg MW20000)使其終濃度為0.05%, 我們對比了BSA和PEG穩(wěn)定膠體金的效果，BSA穩(wěn)定的標記膠體金，放在4℃達2年半仍然保持良好性能，而用PEG穩(wěn)定的標記膠體金放在4℃1年左右就有分層現象，而且染色效果顯著下降。因此，我們認為最好還是用BSA作穩(wěn)定劑。
（4)將標記好的膠體金裝入透析袋中，兩頭扎緊，放入蔗糖或硅膠中濃縮，濃縮到原體積的1/10量，濃縮完畢后純化。離心法純化時，不要濃縮。
標記好的免疫金探針必須經過純化處理以后才能用于免疫細胞化學染色。純化的目的是除去其中未標記的蛋白質，未充分標記的膠體金以及在標記過程中可能形成的各種聚合物。
（1)將標記的大于10nm的膠體金溶液選用15000r/min 4℃離心15min，吸出上清，棄去沉淀，以去除大的聚合物。
（2)一般在10nm以上所標記的膠體金均可在調整離心機上離心，小于10nm顆粒的膠體金用超速離心機離心，在4℃離心1h左右，棄上清，將沉淀以原體積的0.02mol./l TBSpH8.2（內含1%BSA，0.05%疊氮鈉)溶解，重復離心2～3次，沉淀溶于原體積的1/10TBS中。4℃保存?zhèn)溆�。為了得到顆粒均勻一致的免疫金試劑，上述粗提制劑可用10%～30%蔗糖或甘油溶液作密度梯度離心，分帶收集不同大小顆粒的膠體金標記蛋白制劑。
幾種免疫金探針離心所用轉速（見表5-6)，離心純化時所用轉速見表5-7，膠體金的OD值見表5-8。
表5-6 幾種免疫金探針離心時所用轉速參考表
| 膠體金顆粒直徑（nm) | 蛋白質 | 時間（min) | 轉速（r) |
| 3.0 | GAR IgG | 60 | 30000 |
| 5.0 | GAR IgG | 50 | 25000 |
| 10.0 | RAM IgG | 50 | 19000 |
| 15.0 | SPA | 40 | 17000 |
| 15.0 | ALcc IgG | 40 | 17000 |
| 20.0 | SPA | 40 | 13000 |
| 25.0 | SPA | 35 | 12000 |
說明：GAR IgG=羊抗兔IgG；RAm IgG=兔抗鼠IgG；ALcc IgG=抗肝細胞癌IgG; SPA=葡萄球菌A蛋白
表5-7 幾種免疫金探針離心純化時所用轉速
| 膠體金顆粒（nm) | pH | 蛋白質 | 轉速（xg) | 時間（min) |
| 5 | 9.0 | 羊抗人IgG | 45000 | 45 |
| 10 | 8.2 | 抗胃癌單克隆抗體 | 45000 | 30 |
| 15 | 6.5 | 鏈霉親和素 | 12000 | 45 |
| 20 | 6.0 | SPA | 12000 | 30 |
將純化好的膠體金用0.02mol/l TBS緩沖液作1：20稀釋，用520nm測OD值。
表5-8 不同大小膠體金的OD值
| 膠體金顆粒大小（nm) | OD（520)nm |
| 5 | 2.5 |
| 10 | 2.5 |
| 15 | 3.5 |
| 20 | 5.0 |
為純化免疫金探針的最好方法，其特點是簡便，過濾的膠體金顆粒比較均勻，不容易凝集，而離心方法轉速高，時間長，膠體金顆粒沉淀容易凝集，用凝膠過濾克服了這一弱點。選用本方法時膠體金溶液必須用牛血清白蛋白作穩(wěn)定劑。具體操作過程如下：
（1)將濃縮好的膠體金以1500r/min離心去掉大的聚合物。吸出上清待過柱。
（2)柱高34cm,直徑1cm,加樣體積為柱床體積的1/10。
（3)丙烯葡聚糖S-400（Sephacryls—400, Pharmacia, Sweden)裝柱后用0.02mol/lpH8.2TBS平衡層析柱（pH7.4者用于標記的SPA)，平衡好后，吸取上清膠體金液體加入層析柱內，加樣時請注意不要破壞S—400的界面。
（4)用0.02mol/lpH8.2 TBS洗脫，先行濾出的液體有少量微黃不透亮的液體，緊接著是濃度高紅色而透亮的膠體金，注意顏色的變化，如紅色變淡，變黃立刻停止收集。如Sephacryls—400沒有，也可以用Sepharose –4B或6B代替（Pharmacia,Sweden)也能收到較好的效果。
（1)用有Formvar 膜的鎳網沾取金標蛋白溶液，空氣中干燥后醋酸鈾復染，在TEM下觀察，可見金顆粒周圍有一明顯的空暈，表示顆粒表面吸附有蛋白質分子。
（2)純化后免疫金探針是否保持很好的生物學活性是判斷其質量好壞的主要指標，因此，在使用之前必須對它的特異性，敏感性進行鑒定。鑒定舉例，用陽性抗原片，脫蠟至水，胰蛋白酶消化，加第一抗體（多克隆或單克隆)，一般過夜再加標記抗同一抗特異性抗體結合的膠體金溶液（多克隆或單克隆抗體標記的膠體金)詳細方法步驟見后IgGS法，一般做1：2，1：4，1：8，1：16，稀釋SPA-金，做1：10，1：20，1：40，1：80稀釋，37℃45min，沖洗，顯色，觀察結果，染色效價以陽性結果明確，背景淺的稀釋度為標準。免疫細胞化學染色試驗可以較全面地反應免疫金探針的質量。
