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齲病是兒童最常見的一種口腔疾病。引起齲齒發(fā)生的因素很多，其中細菌因素是主要因素[1]。兒童齲病最主要的致病菌為變異鏈球菌和乳桿菌[2]，近年來有研究表明，雙歧桿菌(Bifidobacterium)也可能是兒童深齲的致病菌之一[3]。雙歧桿菌是口腔常駐菌，它與齲病的關(guān)系已逐漸被關(guān)注。雙歧桿菌屬是一群具有多形態(tài)、無動力的革蘭陽性無芽孢厭氧菌，該菌屬首先從嬰兒糞便中分離得到，主要包括青春雙歧桿菌、分叉雙歧桿菌、棲牙雙歧桿菌、齒雙歧桿菌(Bifidobacterium dentium，Bi.dentium)和殊形雙歧桿菌等[4]。雙歧桿菌對機體具有重要的生理作用，被稱為人體益生菌(probiotic)，目前被大量添加在兒童飲品中。該菌屬在人類口腔的分布尚不完全清楚，已分離到的主要為齒雙歧桿菌、棲牙雙歧桿菌和殊形雙歧桿菌[5]。目前關(guān)于雙歧桿菌與口腔疾病的相關(guān)研究較少，與兒童齲關(guān)系的研究就更少;而且尚未發(fā)現(xiàn)較好的分離人類口腔雙歧桿菌的選擇性培養(yǎng)基[6]，也限制了對該菌的研究。本研究在實驗中探索出一種對口腔雙歧桿菌選擇性較好的培養(yǎng)基，并采用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain re-action，PCR)技術(shù)檢測患有重癥嬰幼兒齲(severe earlychildhood caries，S-ECC)和無齲兒童乳牙不同部位菌斑的雙歧桿菌定植情況，初步探討口腔雙歧桿菌與兒童齲的相關(guān)關(guān)系，為生態(tài)防齲提供依據(jù)。
1 材料和方法
1.1 研究對象
隨機選取40例2008年4月至9月期間就診于四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院兒童口腔科的3~6歲患兒為試驗組，其中女18例，男22例，平均年齡4.4歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：診斷為S-ECC的初診兒童，1個月內(nèi)未服用抗生素，無全身系統(tǒng)性疾病及其他口腔疾病。S-ECC診斷標(biāo)準(zhǔn)為[7]：3歲患兒的齲失補牙面數(shù)(decayed，missing or filled surfaces，dmfs)≥4，4歲患兒的dmfs≥5，5歲以上患兒的dmfs≥6。排除標(biāo)準(zhǔn)：口腔齲齒未達到S-ECC的診斷標(biāo)準(zhǔn)，1個月內(nèi)服用過抗生素，全身抵抗力低下或患有系統(tǒng)性疾病。另外隨機抽取四川省成都市武候區(qū)棕北金蘋果幼兒園30例3～6歲無齲兒童作為對照組，其中女14例，男16例，平均年齡4.7歲。對照組要求檢查前1個月內(nèi)未服用抗生素，無系統(tǒng)性疾病和先天性疾病。試驗前向2組兒童的父母說明實驗?zāi)康暮瓦^程，并簽署知情同意書。
1.2 雙歧桿菌選擇性培養(yǎng)基的制作及部分試劑
經(jīng)過多次篩選，本試驗采用經(jīng)過改良的TPY雙歧桿菌選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)雙歧桿菌。在青島高科園海博生物技術(shù)有限公司提供的TPY雙歧桿菌選擇性培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，室溫下在每100 mL培養(yǎng)基加入氯化鋰0.3 g、山梨酸0.04 g、丙酸鈉1 g，pH值調(diào)整為6.5(25 ℃)，高溫滅菌后再加入卡那霉素100 μg·mL-1、硫酸新霉素200 μg·mL-1。采用全基因組DNA提取試劑盒(上海捷瑞生物工程有限公司)提取細菌DNA，用于PCR的特異性引物由大連寶生物工程有限公司合成醫(yī).學(xué).全.在.線gydjdsj.org.cn。
1.3 菌斑標(biāo)本的收集
樣本收集前要求患兒用清水漱口1 min，然后用無菌牙簽收集菌斑標(biāo)本。對照組(無齲組)兒童收集唾液和混合菌斑，菌斑樣本至少取3個牙面(包括唇面、鄰面和面);試驗組(S-ECC組)兒童分別取唾液、光滑面菌斑、牙面白堊斑菌斑及深齲齲壞組織。菌斑收集后，各自分裝于預(yù)先經(jīng)過消毒滅菌、裝有轉(zhuǎn)送液的EP管中(其中S-ECC組齲齒樣本中預(yù)先放置玻璃珠)，1 h內(nèi)送到實驗室完成接種。
1.4 細菌的接種和分離
將轉(zhuǎn)送的樣本混勻，在無菌操作臺上各取15 μL接種于改良過的選擇性培養(yǎng)基，接種后放置厭氧培養(yǎng)箱專性厭氧培養(yǎng)48~72 h。挑選特征性菌落做革蘭染色、耐氧實驗和Rogosa培養(yǎng)基的鑒別培養(yǎng)，將選擇出的細菌進行純化培養(yǎng)、生化試驗和DNA鑒定。為避免遺漏，將一部分樣本接種后的第2代混合細菌直接提取DNA，其后用雙歧桿菌的特異性引物進行種屬鑒定。
