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用pH4.0的0.02 mol/L醋酸鹽緩沖溶液平衡SP650S強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱后上樣,mPEGrhk2a修飾反應(yīng)所得混合產(chǎn)物依次采用鹽離子濃度梯度逐漸變緩的3組緩沖液進(jìn)行洗脫，分離結(jié)果分別如圖1的A、B、C所示洗脫液中溶液電導(dǎo)率在5～7 ms/cm時(shí)，mPEGrhk2a能被洗脫下來(lái)，鹽離子濃度梯度變化越緩，mPEGrhk2a修飾產(chǎn)物各洗脫峰的分離度越高，則可將色譜圖3所對(duì)應(yīng)的洗脫條件作為強(qiáng)陽(yáng)離子交換層析法的最佳分離條件。
收集在最佳分離條件(第3組緩沖液洗脫)下的吸收峰①、②、③、④所對(duì)應(yīng)的流出液，超濾除鹽、凍干，將分離產(chǎn)物進(jìn)行SDSPAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示：mPEG修飾產(chǎn)物與未修飾的rhk2a得到很好的分離，由各電泳條帶的分子量初步判斷，單修飾產(chǎn)物mPEGrhk2a在峰③中出現(xiàn)。
3.3 CM650S弱陽(yáng)離子交換層析法分離修飾產(chǎn)物
用pH 4.0的0.02 mol/L醋酸鹽緩沖溶液平衡CM650S弱陽(yáng)離子交換柱后上樣，mPEGrhk2a修飾反應(yīng)所得混合產(chǎn)物，依次更換含NaCl鹽離子濃度不同的緩沖液進(jìn)行梯度洗脫,結(jié)果如圖3所示,主要修飾產(chǎn)物被穿流洗出。收集圖3中吸收峰①、②、③所對(duì)應(yīng)的流出液，超濾除鹽、凍干，將分離產(chǎn)物進(jìn)行SDSPAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示：mPEGrhk2a修飾產(chǎn)物主要在穿透峰中出現(xiàn)，未修飾的rhk2a在0.1
4 討 論
由于mPEGrhk2a偶聯(lián)蛋白異構(gòu)體除了分子量和表面電荷的細(xì)小差別之外，其他的理化性質(zhì)非常接近，因此偶聯(lián)產(chǎn)物的分離純化一直是蛋白質(zhì)PEG化技術(shù)的難點(diǎn)之一。蛋白質(zhì)與PEG偶聯(lián)之后表面電荷會(huì)發(fā)生變化，利用這種電荷差異可以將偶聯(lián)蛋白分離，故國(guó)內(nèi)外多采用離子交換層析法分離PEG修飾混合物[7]。
rhk2a中N末端氨基與mPEG共價(jià)結(jié)合后，失去與氫質(zhì)子的結(jié)合能力，蛋白質(zhì)分子中的正電荷會(huì)減少，因此mPEGrhk2a的等電點(diǎn)比rhk2a低。另一方面，由于mPEG長(zhǎng)鏈會(huì)阻礙rhk2a與離子交換劑之間的電荷相互作用，即產(chǎn)生立體屏蔽作用，導(dǎo)致mPEGrhk2a在離子交換層析中的流出行為與rhk2a有所不同。這兩方面因素決定采用離子交換層析法能夠分離純化mPEGrhk2a修飾反應(yīng)混合物[7]。
由于陰離子交換樹脂結(jié)合的主要是蛋白質(zhì)的羧基，受氨基修飾影響較小，因而選擇陽(yáng)離子交換樹脂分離純化mPEGrhk2a。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明，用強(qiáng)陽(yáng)離子交換層析法分離mPEGrhk2a修飾反應(yīng)混合物時(shí)，修飾產(chǎn)物mPEGrhk2a在柱上的保留時(shí)間比未修飾的rhk2a要短。說(shuō)明mPEG修飾確實(shí)降低了rhk2a的等電點(diǎn)，屏蔽了rhk2a與離子交換劑之間的靜電作用，使得在相同pH值條件下，修飾產(chǎn)物在柱上的吸附能力較弱。
用弱陽(yáng)離子交換層析法分離mPEGrhk2a時(shí)，mPEGrhk2a修飾產(chǎn)物主要在穿透峰中出現(xiàn)，是因?yàn)閙PEG修飾顯著地降低了mPEGrhk2a的等電點(diǎn)，導(dǎo)致弱陽(yáng)離子交換層析柱對(duì)mPEGrhk2a的結(jié)合力太弱，無(wú)法獲得理想的分離效果。
本研究證明，修飾產(chǎn)物mPEGrhk2a,在平衡液的pH值為4.0時(shí)，與SP650S強(qiáng)陽(yáng)離子交換層析柱有良好的結(jié)合;在洗脫液中溶液電導(dǎo)率在5～7 ms/cm時(shí)，可被洗脫下來(lái)，并且與未修飾的rhk2a分離度良好，因此獲得了純度較高的mPEGrhk2a，為下一步的深入研究奠定了基礎(chǔ)醫(yī).學(xué)全.在.線網(wǎng)站gydjdsj.org.cn。
