醫(yī)學(xué)論文范文:聚乙二醇修飾�？�神經(jīng)毒素rhk2a的分離與純化

1 材料與儀器

SP��650S強(qiáng)陽離子交換層析柱料、CM��650S弱陽離子交換層析柱料(日本TOSOH公司生產(chǎn)); Amicon TM Stirred Cell超濾裝置、再生纖維素超濾膜(截留分子量1000)(美國Millipore公司);Biologic LP層析系統(tǒng)(美國Bio�睷ad公司);BETA1��8K型冷凍干燥機(jī)(德國CHRIST公司);Delta320pH計(jì)(梅特勒�餐欣�多公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

將rhk2a按照最佳工藝條件修飾后得到的mPEG�瞨hk2a 修飾反應(yīng)混合物， 用截流分子量為 1 000的超濾膜超濾除鹽，然后用被緩沖溶液平衡后的陽離子層析柱進(jìn)行分離純化[3,4]，考察不同鹽離子濃度緩沖液的分離效果，收集各洗脫峰的流出液，將收集液超濾除鹽后， 轉(zhuǎn)入50 mL離心管中， 于-80 ℃下預(yù)凍3～4 h，在-35～-20 ℃下抽真空冷凍干燥24 h，所得產(chǎn)物用Tris�睺ricine系統(tǒng)進(jìn)行SDS�睵AGE電泳檢測。

　2.1 平衡、洗脫緩沖液pH值的選擇

2.1.1 SP��650S強(qiáng)陽離子交換層析柱平衡、洗脫緩沖液pH值的選擇 取試管7支，各加 1 g SP��650S強(qiáng)陽離子交換層析柱料后，分別用純水洗滌，每次10 mL，洗5次�？紤]到mPEG�瞨hk2a的穩(wěn)定性[5,6]，各加入pH值分別為4.0、4.6、5.0、5.4的醋酸鈉�泊姿峋彌_液與pH值分別為6.0、6.5、7.0的磷酸鈉�擦姿峋彌_液淋洗，每次10 mL，洗5次，待柱料平衡穩(wěn)定，在每管中加入2 mg 的mPEG�瞨hk2a，搖動(dòng)試管5～15 min，靜置待柱料下沉，取每管上清液于280 nm下測定其紫外吸收值。

2.1.2 CM��650S弱陽離子交換層析柱平衡、洗脫緩沖液pH值的選擇 取試管7支，各加 1 g CM��650S弱陽離子交換層析柱料后，余下操作同“2.1.1”醫(yī).學(xué)全.在.線網(wǎng)站gydjdsj.org.cn。

2.2 2種離子交換層析柱分離純化修飾產(chǎn)物的條件

SP��650S強(qiáng)陽離子交換層析柱的規(guī)格為2.6 cm×4 cm(柱容量1 CV=25 mL)，柱平衡液為3 CV的pH4.0的0.02 mol/L醋酸鹽緩沖液，流速為1 mL/min，檢測波長為280 nm，色譜柱清洗液為5 CV 的0.5 mol/L NaOH溶液。CM��650S弱陽離子交換層析法的色譜條件同上。

SP��650S強(qiáng)陽離子交換層析法用于梯度洗脫的緩沖液見表1;CM��650S弱陽離子交換層析法依次更換的洗脫液為NaCl含量分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1 mol/L 的pH 4.0的0.02 mol/L醋酸鹽緩沖液各5 CV。

3 結(jié) 果

3.1 SP��650S強(qiáng)陽離子交換層析和CM��650S弱陽離子交換層析洗脫條件的選擇與比較表1 SP��650S強(qiáng)陽離子交換層析法所用的梯度洗脫液醋酸鹽緩沖液的比例第一組100%→0%0%→100%(20 CV)第二組前半段100%→40%0%→60%(20 CV)后半段40%→0%60%→100%(10 CV)第三組100%→50%0%→50%(20 CV)

用一系列不同pH值的緩沖液平衡2種離子交換層析柱料，測得其相應(yīng)上清液的紫外吸收值，結(jié)果如表2所示，隨著緩沖溶液pH值的升高，上清液的紫外(UV)吸收值增加，即洗脫液中的蛋白質(zhì)含量增加;緩沖液的pH值越低，離子交換柱料與mPEG�瞨hk2a的結(jié)合量越大,在同一pH值下，SP��650S強(qiáng)陽離子交換柱料的mPEG�瞨hk2a結(jié)合情況優(yōu)于 CM��650S弱陽離子交換柱料。因此，選用pH4.0的0.02 mol/L醋酸鹽緩沖液平衡、洗脫2種層析柱，此時(shí)色譜柱有效交換容量最大，mPEG�瞨hk2a的分離效果相對較好。表2 不同pH值緩沖液下SP��650S與CM��650S柱料上清液的紫外吸收值

3.2 SP��650S強(qiáng)陽離子交換層析法分離修飾產(chǎn)物

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