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與正常對(duì)照組比 ^P<0.05;與10%新生牛血清組比 #P<0.05;與17β_雌二醇+10%新生牛血清組比 ##P<0.052.3 17β_雌二醇抑制VSMCs增殖過程中caveolin_1蛋白表達(dá)情況10%新生牛血清作用24h可明顯降低caveolin_1蛋白表達(dá)(n=3，P<0.05，圖3、4)，提前用17β_雌二醇預(yù)處理細(xì)胞可顯著增加caveolin_1蛋白表達(dá)(n=3，P<0.05)。為探討17β_雌二醇增加caveolin_1蛋白表達(dá)抑制VSMCs增殖是否通過雌二醇受體，我們選用他莫昔芬提前孵育細(xì)胞2h，結(jié)果表明，他莫昔芬孵育組caveolin_1蛋白表達(dá)下降(n=3，P<0.05)，而他莫昔芬單獨(dú)作用對(duì)VSMCs增殖無影響。圖3 用Western blot檢測(cè)17β_雌二醇及他莫昔芬對(duì)VSMCs中caveolin_1蛋白表達(dá)的結(jié)果(1正常對(duì)照組 210%新生牛血清組 310%新生牛血清+17β_雌二醇組 410%新生牛血清+17β_雌二醇+他莫昔芬組 5他莫昔芬組)
與正常對(duì)照組比 ^P<0.05;與10%新生牛血清組比 #P<0.05;與10%新生牛血清+17β_雌二醇組比 ##P<0.052.4 17β_雌二醇抑制VSMCs增殖過程中iNOS蛋白表達(dá)情況10%新生牛血清作用24h可明顯降低iNOS蛋白表達(dá)(n=3，P<0.05，圖5、6)，若提前用17β_雌二醇預(yù)處理VSMCs，可顯著增加iNOS蛋白表達(dá)(n=3，P<0.05)。且β_MCD提前孵育VSMCs可抑制17β_雌二醇誘導(dǎo)的iNOS蛋白表達(dá)增加。圖5 β_MCD對(duì)VSMCs中iNOS蛋白表達(dá)Western blot結(jié)果(1正常對(duì)照組 210%新生牛血清+17β_雌二醇+β_MCD組 3β_MCD組 410%新生牛血清組 510%新生牛血清+17β_雌二醇組)
與正常對(duì)照組比 ^P<0.05;與10%新生牛血清組比 #P<0.05;與10%新生牛血清+17β_雌二醇組比 ##P<0.052.5 17β_雌二醇對(duì)VSMCs中NO合成的影響與正常對(duì)照組比，10%新生牛血清孵育后，VSMCs中NO表達(dá)下降(n=6，P<0.05，圖7)，而用17β_雌二醇提前孵育細(xì)胞可明顯增加NO濃度(n=6，P<0.05)。加入L_NAME或β_MCD后，可抑制17β_雌二醇誘導(dǎo)的NO合成增加(n=6，P<0.05)。
3 討論
VSMCs過度增殖和遷移以及由此引起的細(xì)胞外基質(zhì)的大量合成是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓和經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈內(nèi)成形術(shù)術(shù)后管腔再狹窄的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1_2]。研究表明，位于VSMCs膜上caveolae結(jié)構(gòu)是介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的中心，而其標(biāo)志性蛋白caveolin_1可通過其腳手架結(jié)構(gòu)與多種信號(hào)蛋白相連接，起著調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的開關(guān)作用。VSMCs過度增殖與遷移是促進(jìn)動(dòng)脈粥樣斑塊形成的主要因素。LIN等[4]選用高脂飲食誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化模型，結(jié)果顯示：高脂飲食第5周血管內(nèi)膜中caveolin_1表達(dá)達(dá)到最高峰，此后開始下降，并于動(dòng)脈粥樣斑塊形成的第8周，其表達(dá)下降至最低;而VSMCs增殖則在第5周開始逐漸增強(qiáng)，并于8～12周其增殖能力最強(qiáng)，提示caveolin_1表達(dá)與VSMCs增殖及動(dòng)脈粥樣斑塊形成之間存在密切關(guān)聯(lián)。內(nèi)皮素受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體中的一員，定位于caveolae中，與caveolin_1相連，內(nèi)皮素_1與其受體結(jié)合后，通過增加caveolin_1蛋白表達(dá)，增強(qiáng)鈣通道開放，增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度[5_6]，抑制VSMCs增殖。血管緊張素Ⅱ是誘導(dǎo)VMSCs增殖的重要刺激因子，它可以通過與其受體結(jié)合，通過調(diào)節(jié)caveolin_1，促進(jìn)活性氧依賴的表皮生長(zhǎng)因子受體轉(zhuǎn)錄及增加Akt活性，誘導(dǎo)VSMCs增殖[7]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，新生牛血清可通過抑制caveolin_1蛋白表達(dá)，促進(jìn)VSMCs增殖;而17β_雌二醇預(yù)處理可通過增加caveolin_1表達(dá)，抑制新生牛血清誘導(dǎo)的VSMCs增殖醫(yī).學(xué)全.在.線網(wǎng)站gydjdsj.org.cn。
NO是一種內(nèi)皮依賴性松弛因子，具有極強(qiáng)的舒張血管效應(yīng)，同時(shí)還可抑制血小板聚集和血栓形成。一氧化氮合酶是NO合成的關(guān)鍵酶，VSMCs中主要表達(dá)iNOS。白藜蘆醇是紅酒中參與血管保護(hù)的重要因子，它可通過增加iNOS活性，促進(jìn)NO合成與釋放，抑制VSMCs增殖。研究發(fā)現(xiàn)，17β_雌二醇受體阻斷劑ICI 182，780提前孵育可逆轉(zhuǎn)此效應(yīng)，提示白藜蘆醇是通過與雌二醇受體結(jié)合，發(fā)揮其抑制VSMCs增殖的效應(yīng)[8]。RODRGUEZ等[9]研究表明，瘦素可抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的VSMCs增殖，在此過程中，磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子和轉(zhuǎn)錄活化因子(STAT3)及Akt蛋白表達(dá)增加，iNOS活性及NO合成增加，若用Janus激酶(JAK2)阻斷劑AG490或磷脂酰肌醇(_3)激酶(PI3K)阻斷劑wortmannin可顯著抑制瘦素誘導(dǎo)的iNOS活性增加，提示，瘦素可通過激活JAK2/STAT3及PI3K/Akt信號(hào)途徑，增加iNOS活性，促進(jìn)NO合成，抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的VSMCs增殖。我們的研究結(jié)果同樣顯示，17β_雌二醇可通過增加iNOS活性及蛋白表達(dá)，促進(jìn)NO合成，抑制新生牛血清誘導(dǎo)的VSMCs增殖。為進(jìn)一步探討17β_雌二醇抑制VSMCs增殖過程中，caveolin_1表達(dá)增加與iNOS之間的關(guān)系，我們選用β_MCD預(yù)處理，抑制caveolin_1表達(dá)，結(jié)果顯示iNOS蛋白表達(dá)下降，NO合成減少。
