實(shí)驗(yàn)二十四 細(xì)菌DNA限制性核酸內(nèi)切酶分析
【原理】
限制性核酸內(nèi)切酶能識(shí)別和切割雙鏈DNA的特異部位，產(chǎn)生系列DNA片段，這些片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后可顯示為不同的帶譜，這些帶譜就構(gòu)成了各不同雙鏈DNA的特征性“指紋(fingerprint)”。
【材料】
1．限制性核酸內(nèi)切酶 目前常用的有HindⅢ、BamH I、EcoRI、Past I、XhoI、PvuⅡ等，各種酶通常各有其最佳的工作條件，在商品說(shuō)明書上均有詳細(xì)介紹，包括酶的識(shí)別序列、最適反應(yīng)條件、溫度及貯存條件等參數(shù)，故使用前應(yīng)仔細(xì)閱讀說(shuō)明書。
2．細(xì)菌DNA 按常規(guī)方法提取、純化細(xì)菌DNA、瓊脂糖、TAE或TBE電泳緩沖液。
3．電泳儀、水平電泳槽、252nm紫外燈。
【方法】
用電泳緩沖液將瓊脂糖配制成所需濃度，加于水平玻璃板醫(yī)學(xué)全.在線上制成凝膠，待凝固后在加樣孔中加入經(jīng)內(nèi)切酶切割消化的DNA樣品，電泳時(shí)電壓2～5v/cm，電泳時(shí)間8～12min，電泳完畢后將凝膠浸于含0.5μg/ml溴乙錠的電泳緩沖液中染色30min，紫外燈照射下拍照。
【意義】
各種屬細(xì)菌的酶切圖譜有明顯不同，同種不同型、甚至同型不同株的細(xì)菌也可能在圖譜上顯示其差異。限制性內(nèi)切酶分析法重復(fù)性、穩(wěn)定性、敏感性均較好，且操作簡(jiǎn)便，可快速得到結(jié)果，因此在細(xì)菌的鑒定、分型及進(jìn)行分子流行病學(xué)研究等方面應(yīng)用較廣。
