第三部分 細(xì)胞免疫檢測(cè)技術(shù)
體外測(cè)定細(xì)胞免疫功能，首先需要從人或動(dòng)物外周血獲取有活性的免疫細(xì)胞，包括通過(guò)分離外周血單個(gè)核細(xì)胞獲取淋巴細(xì)胞，如采用尼龍毛柱法和E花結(jié)法分離T淋巴細(xì)胞等。
實(shí)驗(yàn)一 免疫細(xì)胞分離技術(shù)
一、外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離
外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral bloodmononuclear cells，PBMC)包括血液中的淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，PBMC是進(jìn)行細(xì)胞免疫學(xué)試驗(yàn)最常用的細(xì)胞，目前常用Ficoll密度梯度離心法直接分離。
【原理】
PBMC與血液中其它血細(xì)胞的比重略有不同，紅細(xì)胞、粒細(xì)胞比重較大(1.092左右)，PBMC比重較小(1.075～1.090)。將抗凝血置于一定比重(1.075～1.092)的淋巴細(xì)胞分離液之上，經(jīng)一定速度離心后形成密度梯度細(xì)胞層：紅細(xì)胞、粒細(xì)胞比重較大，離心后沉于管底；比重與分層液接近的PBMC，離心后密集于血漿層與分層液的界面；血小板因比重小而懸浮于血漿中，由此可獲得較純的PBMC。
【材料】
1．淋巴細(xì)胞分離液 即聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin，商品名常用Isopaque或Hypaque)分層液，又名Ficoll-Hypaque分層液，比重1.077±0.001。
2．肝素抗凝劑 用Hanks液或生理鹽水稀釋成1000u／ml，肝素用量約為20u／1ml血。
3．Hanks液 pH7.2～7.4，無(wú)Ca2+、Mg2+（配制見(jiàn)附錄)。
4．10%小牛血清RPMI1640（配制見(jiàn)附錄)。
5．0.4%臺(tái)酚藍(lán)染色液 用生理鹽水配制（配制見(jiàn)附錄)。
6．血球計(jì)數(shù)板、顯微鏡、水平式離心機(jī)；無(wú)菌試管、毛細(xì)滴管和刻度吸管等。
【方法】
1．靜脈取血1～2ml，注入盛有肝素(約20u/ml血)的無(wú)菌試管內(nèi)搖勻，使血液抗凝，抗凝血用等量Hanks液稀釋?zhuān)⒊浞只靹颉?/p>
2．取無(wú)菌中試管一支，自管底加入1.5～2ml淋巴細(xì)胞分離液(保持分離液液面之上管壁不受玷污)。
3．用滴管將稀釋后的抗凝血沿試管壁緩慢疊加于分層液面上，應(yīng)保持兩種液體界面清晰。
4．平衡試管重量后置于水平式離心機(jī)內(nèi)離心2000rpm，20min。離心后管內(nèi)容物分為三層，上層為血漿和Hanks液，中層為淋巴細(xì)胞分離液，下層主要為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞。在上、中層界面處有一個(gè)富含單個(gè)核細(xì)胞的白色云霧狀狹窄帶(圖3-1)。
5．將毛細(xì)吸管輕輕插到白色云霧層，吸出該層細(xì)胞，置入另一支無(wú)菌試管中，加入５倍以上體積的Hanks液洗滌細(xì)胞2～3次，每次離心1500rpm， 10min，吸棄上清。
6．最后一次吸棄上清后，加入適量含有10%小牛血清的RPMI1640，重懸細(xì)胞。取0.1ml細(xì)胞懸液與等量0.4%臺(tái)酚藍(lán)染液混合，于血球計(jì)數(shù)板上，計(jì)數(shù)四個(gè)大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)。
7．細(xì)胞活力檢測(cè) 死的細(xì)胞可被染成藍(lán)色，活細(xì)胞不著色。計(jì)數(shù)200個(gè)淋巴細(xì)胞，計(jì)算出活細(xì)胞百分率。
【結(jié)果】
4個(gè)大方格內(nèi)細(xì)胞總數(shù)
PBMC濃度(細(xì)胞數(shù)／毫升懸液)＝ ×100×稀釋倍數(shù)
4
活細(xì)胞數(shù)
活細(xì)胞(%) ＝ ×100%
總細(xì)胞數(shù)
用本法分離PBMC，純度在90%以上，收獲率可達(dá)80%～90%，活細(xì)胞百分率在95%以上�！ �
|
|
|
|
|
|
離心前 離心后
圖3-1 PBMC的分離
【注意事項(xiàng)】
1．將稀釋的抗凝血加于分層液上時(shí)，要沿管壁緩慢加入，使分層液與血液的界面十分清晰，避免血液沖散分層液的液面而影響分離效果。
2．用毛細(xì)吸管吸取富含PBMC的白色云霧層時(shí)，動(dòng)作要輕巧，最好一次吸完，避免將白色云霧層沖混。
3．操作全程應(yīng)盡可能快地完成，以免死細(xì)胞數(shù)增加�；罴�(xì)胞百分率過(guò)低可能會(huì)影響某些試驗(yàn)的正常進(jìn)行。
4．用淋巴細(xì)胞分離液分離PBMC時(shí)，必須使用水平式離心機(jī)，離心機(jī)轉(zhuǎn)速的增加和減少要均勻、平穩(wěn)，以保持界面的清晰。
5．分離不同動(dòng)物血中的PBMC，對(duì)分層液比重的要求不同，如小鼠為1.088，馬為1.090等。
【思考題】
1．你認(rèn)為本次試驗(yàn)成敗的關(guān)鍵因素是什么？應(yīng)該怎樣把握？
2．現(xiàn)分離得到10ml單個(gè)核細(xì)胞懸液，加臺(tái)酚藍(lán)染液對(duì)倍稀釋后充池計(jì)數(shù)4大方格，未著色細(xì)胞為400，若要校正活細(xì)胞濃度為1×105/ml，如何進(jìn)行校正？若要同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞活力檢測(cè)，應(yīng)如何計(jì)數(shù)和計(jì)算？
3．上述PBMC細(xì)胞濃度的計(jì)算公式中，乘以100是什么意思？
二、T、B淋巴細(xì)胞的分離
T細(xì)胞與B細(xì)胞表面粘附特性和表面受體不同，借此可將T、B細(xì)胞分離開(kāi)。常用的方法有尼龍毛分離法和E花結(jié)分離法。
(一)尼龍毛分離法
【原理】
B細(xì)胞表面凹凸不平，37℃時(shí)易粘附于尼龍毛表面，而T細(xì)胞表面光滑，無(wú)粘附作用。淋巴細(xì)胞在通過(guò)裝有尼龍毛的柱時(shí)，B細(xì)胞被吸附于柱上，而T細(xì)胞不被吸附隨液體流出，借此將T、B細(xì)胞分離開(kāi)。
【材料】
1．標(biāo)本 外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)懸液。
2．試劑 Hanks液，含20%FCS(胎牛血清)的RPMI 1640培養(yǎng)液。
3．器材 尼龍毛(尼龍纖維，上�；w九廠，3D尼龍-6短纖維)、水平式離心機(jī)、10ml注射器、試管、毛細(xì)吸管等。
【方法】
1．尼龍毛柱的制備
⑴ 將尼龍毛放入燒杯內(nèi)，加雙蒸水煮沸10min，置尼龍毛于漏斗內(nèi)瀝干。重復(fù)上述過(guò)程6次，最后兩次煮沸用去離子水(國(guó)產(chǎn)的尼龍毛需事先用0.2N鹽酸浸濕數(shù)小時(shí)，取出后用雙蒸水反復(fù)沖洗，再按上述方法處理)。
⑵ 稱(chēng)取尼龍毛，將其仔細(xì)撕開(kāi)，使其松散均勻，裝入注射器，高壓滅菌(可根據(jù)過(guò)柱的細(xì)胞總數(shù)來(lái)確定注射器的大小和尼龍毛的重量，見(jiàn)表３-1)。
⑶ 用前將柱內(nèi)尼龍毛用37℃預(yù)溫的RPMI 1640培養(yǎng)液浸潤(rùn)，于37℃靜置30min，然后分別用Hanks液和RPMI 1640培養(yǎng)液各5ml洗柱，流速2ml/10s。
2．1×108個(gè)PBMC重懸在1～2ml含20%FCS的RPMI 1640培養(yǎng)液中，將細(xì)胞懸液裝柱，水平置37℃孵育60min。
3．用37℃預(yù)溫的含20%FCS的RPMI 1640培養(yǎng)液洗脫尼龍毛柱2次，流速1滴/s。洗脫液中富含T細(xì)胞。
4．用冷的RPMI 1640培養(yǎng)液洗脫尼龍毛柱2次，邊洗邊擠壓，洗脫液中富含B細(xì)胞。
【結(jié)果】
本法分離所得的T細(xì)胞純度可達(dá)80%～90%，B細(xì)胞純度可達(dá)70%～80%，細(xì)胞活力可達(dá)90%以上�？捎脽晒鈽�(biāo)記CD3單抗(或E花環(huán)形成試驗(yàn))鑒定T細(xì)胞純度，用抗Ig熒光抗體法鑒定B細(xì)胞純度，用臺(tái)酚藍(lán)染色法鑒定細(xì)胞活力。
表３-1 裝尼龍毛柱所用的注射器大小和尼龍毛重量
細(xì)胞數(shù)量 注射器容量(ml) 尼龍毛重量/注射器 尼龍毛在注射器內(nèi)體積
1×108 10～12 0.6g 6ml
3×108 351.6g18ml
4×108 352.4g24ml
【注意事項(xiàng)】
1．尼龍毛柱的質(zhì)量直接影響到分離效果。尼龍毛柱應(yīng)均勻、松散、連續(xù)、不留氣泡。裝柱的長(zhǎng)度應(yīng)與分離的細(xì)胞成正比，一般柱高6cm，可有效濾過(guò)2～3×107個(gè)細(xì)胞。
2．用手?jǐn)D壓尼龍毛柱時(shí)，柱內(nèi)一定要充滿液體。擠壓時(shí)用力要適度，用力過(guò)重，會(huì)損傷B細(xì)胞，還會(huì)將粘附力大于B細(xì)胞的單核細(xì)胞也隨之?dāng)D下；用力過(guò)輕則會(huì)使B細(xì)胞流出不全。
3．沖洗尼龍毛柱時(shí)應(yīng)注意溶液及環(huán)境的溫度。溫度過(guò)低，B細(xì)胞和單核細(xì)胞易脫落，使T細(xì)胞純度下降，B細(xì)胞得率降低。
4．有些T細(xì)胞亞群可能滯留在柱內(nèi)。
5．尼龍毛可回收利用。用過(guò)的尼龍毛可用生理鹽水漂洗，然后放入0．1N鹽酸內(nèi)過(guò)夜，洗滌程序同前。
【思考題】
1．尼龍毛分離法分離T、B細(xì)胞的原理是什么？PBMC懸液中所含的單核細(xì)胞能否除去？為什么？
2．收集B細(xì)胞擠壓尼龍毛柱時(shí)應(yīng)注意什么？為什么？
3．用該法分離得到的T、B細(xì)胞如何進(jìn)行純度和活力鑒定？
（二)E花結(jié)分離法
【原理】
人類(lèi)T細(xì)胞表面具有能與綿羊紅細(xì)胞結(jié)合的受體(E受體，即CD2)，可與綿羊紅細(xì)胞結(jié)合形成E花結(jié)。形成E花結(jié)后的T細(xì)胞，體積和比重較其它細(xì)胞大，可通過(guò)速率沉降(rate sedimentation，即體積分離)或平衡沉降(equilibrium sedimentation，即密度分離)將T細(xì)胞與B細(xì)胞加以分離。T細(xì)胞形成的E花結(jié)在37℃穩(wěn)定性較差，采用還原劑AET(溴化二氨基異硫氫化物2-amino ethyl isothiourniumbromide bydrobromide)或神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase)預(yù)處理綿羊紅細(xì)胞，可使T細(xì)胞形成大而穩(wěn)定的花結(jié)，且花環(huán)形成快速、形成率高。經(jīng)分層液密度梯度離心后，能形成E花結(jié)的T細(xì)胞沉于管底，而不能形成E花結(jié)的細(xì)胞(如B細(xì)胞和單核細(xì)胞)則在分層液的界面。將E花結(jié)形成細(xì)胞用低滲溶液處理，溶解綿羊紅細(xì)胞，即可獲得較純的T細(xì)胞。
【材料】
1．阿氏液（配制見(jiàn)附錄)、新鮮綿羊抗凝血、pH7.2的PBS、神經(jīng)氨酸酶、AET、Tris-氯化胺溶液(1mol／L氯化胺以9∶1比例與0.17mol／L Tris溶液混合，調(diào)pH至7.2，過(guò)濾，4℃保存)、RPMI 1640、淋巴細(xì)胞分離液等。
2．試管、毛細(xì)吸管、水浴箱、水平離心機(jī)等。
【方法】
1．用神經(jīng)氨酸酶處理的綿羊紅細(xì)胞(SRBC)分離T細(xì)胞
⑴ 神經(jīng)氨酸酶處理的SRBC的制備 取用阿氏液對(duì)倍稀釋的綿羊抗凝血20～30ml，用PBS洗滌三次(2000 rpm，5min)。末次洗滌后將綿羊紅細(xì)胞重懸在20ml RPMI 1640培養(yǎng)基中，加入0.5ml神經(jīng)氨酸酶(1u／m1)，然后置于37℃水浴中孵育30min，再用PBS洗滌SRBC兩次。末次洗滌棄上清后，按10%(V/V)加RPMI 1640培養(yǎng)基于試管內(nèi)混勻，置4℃可存放兩周左右。
⑵ 分離T淋巴細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞
將3.0～4.0×106個(gè)淋巴細(xì)胞重懸在4ml RPMI 1640培養(yǎng)液中，加lml 10%(V／V)神經(jīng)氨酸酶處理過(guò)的綿羊紅細(xì)胞懸液，混勻。將上述5ml細(xì)胞懸液疊加在3ml淋巴細(xì)胞分離液上，作密度梯度離心1500～2000rpm，20min，吸出界面云霧狀細(xì)胞群，它們是未形成E花環(huán)的細(xì)胞，即B細(xì)胞；沉淀于管底的E花環(huán)陽(yáng)性細(xì)胞為T(mén)細(xì)胞群體。
2．用AET處理的SRBC分離T細(xì)胞
⑴ 稱(chēng)取402mg AET，溶于雙蒸水10ml中配成0.14mol／L溶液。用4mol／L氫氧化鈉溶液調(diào)pH至9.0，現(xiàn)用現(xiàn)配。
⑵ 取離心洗滌后的SRBC，按壓積1∶4的比例加入0.14mol／L AET溶液，充分混勻。37℃孵育15min，每5min搖勻一次。
⑶ 用PBS或Hanks液洗SRBC 5次，用RPMI 1640培養(yǎng)液配成1%(V／V)細(xì)胞懸液。
⑷ 取2～3×106／ml淋巴細(xì)胞懸液與等體積的經(jīng)1%AET處理的綿羊紅細(xì)胞懸液混合，37℃孵育15～20min，每5min搖勻一次。低速離心(500rpm，5min)，4℃孵育40～45min。將該細(xì)胞懸液預(yù)溫至20℃，疊加于淋巴細(xì)胞分離液上作密度梯度離心分離，1500～2000rpm，20min 。余后步驟同神經(jīng)氨酸酶處理的SRBC分離T細(xì)胞法的最后步驟。
【結(jié)果】
沉淀于管底的E花環(huán)形成細(xì)胞即為T(mén)細(xì)胞群體，用低滲的Tris-氯化胺溶液溶解綿羊紅細(xì)胞，即可獲得較純的T細(xì)胞。
【注意事項(xiàng)】
1．約l0%～80%的NK細(xì)胞也能表達(dá)CD2分子，故用此法分離的T淋巴細(xì)胞難免混雜NK細(xì)胞。必要時(shí)可用Percoll非連續(xù)性密度梯度離心法將T細(xì)胞與NK細(xì)胞加以分離。
2．AET處理的綿羊紅細(xì)胞懸液4℃可存放一周，但綿羊紅細(xì)胞懸液有溶血者不宜使用。
3．小牛血清(RPMI 1640培養(yǎng)液中)用綿羊紅細(xì)胞吸收后使用，可除去小牛血清中的凝集素，從而提高T細(xì)胞的分離率。
【思考題】
1．用E花結(jié)分離法分離T細(xì)胞的原理是什么？E花結(jié)形成細(xì)胞均為T(mén)細(xì)胞嗎？為什么？
2．試驗(yàn)中使用的神經(jīng)氨酸酶和AET的作用是什么？
實(shí)驗(yàn)二 E花環(huán)形成試驗(yàn)
【原理】
人類(lèi)T細(xì)胞膜表面有E受體—綿羊紅細(xì)胞(SRBC)受體，在體外一定條件下，當(dāng)T細(xì)胞與SRBC混合并緊密接觸時(shí)，可形成以T細(xì)胞為中心、四周環(huán)繞綿羊紅細(xì)胞的玫瑰花樣花環(huán)，光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)，簡(jiǎn)稱(chēng)E花環(huán)(E為紅細(xì)胞erythrocyte的縮寫(xiě))。根據(jù)E花環(huán)形成細(xì)胞的多少，即可測(cè)知外周血中T細(xì)胞的總數(shù)，即Et(t為total的縮寫(xiě))。其中有一部分T細(xì)胞的E受體對(duì)SRBC有較高的親和力，經(jīng)低速離心后，即可與SRBC形成花環(huán)，此類(lèi)T細(xì)胞稱(chēng)為活性玫瑰花環(huán)形成細(xì)胞，即Ea(a為active的縮寫(xiě))。Ea能反映T細(xì)胞的體內(nèi)功能活性，用以表示機(jī)體細(xì)胞免疫功能和動(dòng)態(tài)變化；Et則代表被檢外周血中T細(xì)胞的總數(shù)和百分率，一般不反映機(jī)體的細(xì)胞免疫功能。
【材料】
1．淋巴細(xì)胞(即PBMC)懸液 用含20%小牛血清的Hanks液(無(wú)Ca2+、Mg2+)將細(xì)胞濃度調(diào)成2.5×106／ml。制備方法見(jiàn)淋巴細(xì)胞分離技術(shù)。
2．Hanks液 不含Ca2+、Mg2+。
3．綿羊紅細(xì)胞(SRBC)懸液。
4．8%戊二醛溶液(用Hanks液稀釋)。
5．HE染色液（配制見(jiàn)附錄)。
6．水平離心機(jī)、水浴箱、冰箱、顯微鏡、血球計(jì)數(shù)板等。
【方法】
1．Et花環(huán)試驗(yàn)
⑴ 分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞，計(jì)數(shù)后配成2.5×106／ml濃度。
⑵ 取保存于Alsever液中的SRBC(或適量新鮮配制的SRBC) 5ml，用Hanks液洗滌3次后，取少量經(jīng)適當(dāng)(約200倍)稀釋后滴于血球計(jì)數(shù)板內(nèi)，鏡下計(jì)數(shù)，配成1.8×108／ml濃度。
⑶ 取0.1ml淋巴細(xì)胞懸液(2.5×106細(xì)胞／ml)和0.1ml SRBC懸液(1.8×108／m1)，加于1支圓底小試管內(nèi)，充分混勻后，置37℃水浴10min。
⑷ 取出后，在水平離心機(jī)內(nèi)離心500rpm，5min，靜置4℃冰箱過(guò)夜。
⑸ 用毛細(xì)吸管吸棄大部分上清液。將試管放在手心輕輕搓動(dòng)，懸起細(xì)胞，加1滴0.8%戊二醛液，輕輕混勻，室溫下靜置5min以固定細(xì)胞。
⑹ 將細(xì)胞懸液傾于載玻片上，輕輕涂布使面積約為1～2cm2。于室溫或37℃溫箱使涂片干燥，HE染色（方法見(jiàn)附錄)，鏡檢(或在第5步后，在試管內(nèi)加1%美藍(lán)1～2滴，室溫下染色3～5min，取1滴細(xì)胞懸液于玻片上，加蓋玻片后在高倍鏡下計(jì)數(shù))。
⑺ 淋巴細(xì)胞周?chē)灿?個(gè)以上綿羊紅細(xì)胞緊密附著者，即為Et花環(huán)形成細(xì)胞。于油鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)淋巴細(xì)胞中的花環(huán)形成細(xì)胞數(shù)，計(jì)算出Et花環(huán)形成的百分率。
2．Ea花環(huán)試驗(yàn)
⑴ 將Et花環(huán)試驗(yàn)用的SRBC稀釋3倍，使成6×107／ml。
⑵ 于圓底小試管內(nèi)加入0.1ml待檢的淋巴細(xì)胞懸液(2.5×106細(xì)胞／ml)和0.1ml SRBC(6×107／ml)，混合后，立即于水平離心機(jī)離心500rpm，5min。
⑶ 棄去大部分上清液，輕輕懸起細(xì)胞，加1滴0.8%戊二醛液固定，靜置5min。
⑷ 其余操作同Et花環(huán)試驗(yàn)中的(6)、(7)項(xiàng)。計(jì)數(shù)Ea花環(huán)百分率。
【結(jié)果】
形成花環(huán)細(xì)胞數(shù)
E花環(huán)形成率(%)=×100%
形成花環(huán)細(xì)胞數(shù) + 未形成花環(huán)細(xì)胞數(shù)
淋巴細(xì)胞周?chē)灿?個(gè)以上綿羊紅細(xì)胞緊密附著者，即為E花環(huán)形成細(xì)胞。健康人外周血Et花環(huán)百分率約為60%～70%，Ea花環(huán)百分率約為20%～30%。
【注意事項(xiàng)】
1．SRBC最好用新鮮的，一般采血后保存于Alsever液中，2周內(nèi)可用。超過(guò)2周，與淋巴細(xì)胞結(jié)合能力下降。
2．從采血到測(cè)定不要超過(guò)4h，分離的淋巴細(xì)胞放置時(shí)間也不要超過(guò)3～4h，否則SRBC受體會(huì)自行脫落�？捎门_(tái)酚蘭檢查淋巴細(xì)胞活力，活細(xì)胞數(shù)應(yīng)不少于95%。
3．計(jì)數(shù)E花環(huán)前，應(yīng)將沉于管底的細(xì)胞予以重懸，但只宜輕緩旋轉(zhuǎn)試管，使細(xì)胞團(tuán)塊松開(kāi)即可，不能強(qiáng)力吹打，以免花環(huán)解離。
4．整個(gè)操作過(guò)程的室溫以16～23℃較好，過(guò)高或過(guò)低會(huì)使E花環(huán)形成率降低。
5．配制PBMC懸液應(yīng)用10%～20%小牛血清為好。不加小牛血清，E花環(huán)形成率降低。
6．SRBC與PBMC的比例，一般以100∶1為宜。
【思考題】
1．Et花環(huán)試驗(yàn)與Ea花環(huán)試驗(yàn)的操作步驟有什么不同？二者的臨床意義有何不同？
2．為什么PBMC與SRBC混合后要進(jìn)行離心沉淀？重懸細(xì)胞時(shí)為什么只能輕緩旋轉(zhuǎn)試管，而不能用力搖勻細(xì)胞懸液？
3．E花環(huán)形成的原理是什么？是否只有T細(xì)胞能形成E花環(huán)？
實(shí)驗(yàn)三 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)
T細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)，受到特異性抗原或促有絲分裂素，如植物血凝素(PHA)或刀豆素A(ConA)刺激后，細(xì)胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)合成增加，同時(shí)細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)化為母細(xì)胞，即為淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。根據(jù)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的高低，可以了解機(jī)體的細(xì)胞免疫水平，常作為檢測(cè)機(jī)體細(xì)胞免疫功能的指標(biāo)之一。試驗(yàn)方法可采用形態(tài)學(xué)計(jì)數(shù)法、3H一胸腺嘧啶核苷(3H—TdR)摻入法等。
一、形態(tài)學(xué)計(jì)數(shù)法
【原理】
T淋巴細(xì)胞表面有植物血凝素(PHA)受體，T細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)，當(dāng)受到非特異性的促有絲分裂素PHA刺激后，進(jìn)行有絲分裂，可轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞，細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯的改變，通過(guò)染色鏡檢，即可計(jì)算出淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率。
【材料】
1．肝素抗凝的新鮮血液標(biāo)本。
2．1%粗制PHA(PHA—M)，無(wú)菌生理鹽水配制(所選用的PHA，最好先測(cè)定最適濃度)。
3．細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液 含20%小牛血清的RPMI 1640，每毫升營(yíng)養(yǎng)液含青、鏈霉素各200單位(小牛血清要經(jīng)56℃30min滅活)。
4．0.87%NH4Cl溶液。
5．瑞氏染液(或姬姆薩染液)。
6．水平離心機(jī)、培養(yǎng)小瓶、吸管、顯微鏡等。
【方法】
1．細(xì)胞培養(yǎng) 取培養(yǎng)小瓶按下列順序加入樣品和試劑
⑴ 3ml細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液。
⑵ 1ml肝素抗凝全血。
⑶ 實(shí)驗(yàn)瓶?jī)?nèi)加0.2m1 PHA(對(duì)照瓶?jī)?nèi)不加PHA)。
⑷ 混勻后將小瓶以30～45度的角度放入37℃溫箱培養(yǎng)72h。
2．制片
⑴ 吸棄瓶?jī)?nèi)上清液。
⑵ 取0.87%NH4Cl溶液3ml左右(一般為血球體積的5倍)，加入瓶?jī)?nèi)充分混勻，置37℃15min以破壞紅細(xì)胞。
⑶ 瓶?jī)?nèi)細(xì)胞懸液移至離心管內(nèi)，加適量生理鹽水混勻后，1000rpm，10min，洗滌兩次。
⑷ 吸棄上清，將混勻后細(xì)胞沉淀物取樣推片，待干燥后作瑞氏染色（染色液配制見(jiàn)附錄)。
3．鏡下計(jì)數(shù)
分別取推片頭、中、尾三段，計(jì)數(shù)200個(gè)淋巴細(xì)胞，包括轉(zhuǎn)化和未轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞。以下三種均可作為轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞（見(jiàn)表3-2)：
⑴ 淋巴母細(xì)胞 體積明顯增大，為成熟淋巴細(xì)胞的3～4倍。核膜清晰、核染色質(zhì)疏松呈細(xì)網(wǎng)狀。核內(nèi)見(jiàn)明顯核仁1～4個(gè)。胞漿豐富，嗜堿性，有偽足樣突起，胞漿內(nèi)有時(shí)可見(jiàn)小空泡。
⑵ 過(guò)渡型淋巴細(xì)胞 具有上述淋巴母細(xì)胞的某些特征。核質(zhì)疏松，可見(jiàn)核仁，胞漿增多，嗜堿性強(qiáng)。比靜止淋巴細(xì)胞大。
⑶ 核分裂細(xì)胞 核呈有絲分裂，可見(jiàn)許多成堆或散在的染色體。
【結(jié)果】
據(jù)上述形態(tài)學(xué)指標(biāo)，計(jì)算出淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的百分率
轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞數(shù)
淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率(%) = ×100%
轉(zhuǎn)化和未轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞總數(shù)
淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率能反映細(xì)胞免疫功能，正常值為60%～80%。
【注意事項(xiàng)】
1．形態(tài)學(xué)計(jì)數(shù)法不需特殊設(shè)備，沒(méi)有放射性污染，一般實(shí)驗(yàn)室均可采用。但判定結(jié)果受主觀因素影響較大，重現(xiàn)性較差，測(cè)定效率低，已逐漸被同位素?fù)饺氲确椒ㄋ〈?/p>
2．培養(yǎng)瓶的玻璃質(zhì)量可影響轉(zhuǎn)化率，可選用中性玻璃小瓶(如鏈霉素或胰島素瓶)；培養(yǎng)瓶應(yīng)有足夠的空間，一般10ml小瓶加2ml培養(yǎng)基較好。
表3-2 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的形態(tài)學(xué)特征
細(xì)胞大小 6～9μm 12～16μm 12～20μm
核大小 核較小、嗜堿性強(qiáng) 核增大、嗜堿性減弱 核大、嗜堿性減弱
染色質(zhì)致密 疏松疏松可呈網(wǎng)狀
核仁 無(wú) 有或無(wú) 清晰，1～3個(gè)
胞漿 極少增多，嗜堿性 增多，嗜堿性
漿內(nèi)空泡 無(wú) 有或無(wú) 有或無(wú)
【思考題】
1．是否可用特異性抗原作為刺激劑進(jìn)行淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)？如果可以，其機(jī)制是什么？轉(zhuǎn)化率與用非特異性有絲分裂素作為刺激劑比較，哪個(gè)轉(zhuǎn)化率高？為什么？
2．除了PHA外，還可用其它非特異性有絲分裂素進(jìn)行淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)嗎？
二、3H—胸腺嘧啶(3H—TdR)摻入法
【原理】
T淋巴細(xì)胞受特異性抗原或PHA刺激后，在轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞的過(guò)程中，DNA合成明顯增加。細(xì)胞轉(zhuǎn)化程度愈高，DNA合成也愈多。此時(shí)若將合成DNA的前體物質(zhì)胸腺嘧啶核苷用放射性同位素3H(氚)標(biāo)記，加入到培養(yǎng)系統(tǒng)中，即可被轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞攝取而摻入DNA分子內(nèi)，培養(yǎng)終止后，測(cè)定淋巴細(xì)胞內(nèi)摻入的3H—TdR的放射量，即能判定淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化程度。此法較形態(tài)學(xué)計(jì)數(shù)法客觀、準(zhǔn)確，重復(fù)性也好，但需一定設(shè)備條件。
【材料】
l．肝素抗凝的新鮮血液標(biāo)本。
2．植物血凝素(PHA，1mg／ml)。
3．細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液（配制方法見(jiàn)附錄)。
4．3H—TdR 100微居里／ml。
5．蒸餾水、5%三氯醋酸、無(wú)水乙醇。
6．玻璃纖維濾膜及負(fù)壓抽濾裝置。
7．閃爍液（配制方法見(jiàn)附錄)及液體閃爍計(jì)數(shù)儀等。
【方法】
（一)微量全血法
1．每份血標(biāo)本用6個(gè)培養(yǎng)瓶，分別加入2ml細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液和0.2ml肝素抗凝新鮮血液。
2．在第1～3瓶?jī)?nèi)各加PHA 0.1ml(最終濃度為25～50微克／毫升)。第4～6瓶不加PHA作為細(xì)胞對(duì)照。
3．放37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)3d。終止培養(yǎng)前12～18h，每瓶?jī)?nèi)加入3H—TdR 1微居里／10微升，繼續(xù)培養(yǎng)。
4．終止培養(yǎng)后，每瓶?jī)?nèi)加入蒸餾水5毫升，溶解紅細(xì)胞。分別吸出各瓶材料置玻璃纖維濾膜上，經(jīng)負(fù)壓抽濾除去未摻入細(xì)胞內(nèi)的游離3H—TdR。再依次用5%三氯醋酸固定，無(wú)水乙醇脫色。
5．將玻璃纖維濾膜置60～80℃烘干，順次放入測(cè)量瓶?jī)?nèi)，加5毫升閃爍液，置液體閃爍計(jì)數(shù)儀內(nèi)測(cè)量樣品的放射性，以每分脈沖數(shù)(cpm)表示。
（二)分離淋巴細(xì)胞3H—TdR摻入法
此法原理、材料同上。
1．按“外周血淋巴細(xì)胞分離技術(shù)”分離和制備淋巴細(xì)胞懸液，用細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106／ml。
2．試驗(yàn)在96孔微量培養(yǎng)塑料板上進(jìn)行，每份標(biāo)本加6孔。3孔為試驗(yàn)孔(3個(gè)復(fù)孔)，每孔加細(xì)胞懸液0.1ml、PHA 20μg／0.1ml。另外3孔為對(duì)照孔，每孔加細(xì)胞懸液0.lml，營(yíng)養(yǎng)液0.1ml。
3．置37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱56h后，每孔加3H—TdR 1微居里／10μl，繼續(xù)培養(yǎng)16h。
4．終止培養(yǎng)，用多頭細(xì)胞收集器收集細(xì)胞于玻璃纖維濾紙上。用生理鹽水充分洗滌，以洗除游離的3H—TdR。
5．滴加5%三氯醋酸5ml固定細(xì)胞，并除去酸溶性小細(xì)胞。
6．滴加無(wú)水乙醇5ml脫水、脫色。
7．同上法“5”。
【結(jié)果】
1．計(jì)算刺激組(加PHA刺激)及細(xì)胞對(duì)照組(未加PHA)3份樣品的cpm均值(每一標(biāo)本作三份復(fù)管)。
2．計(jì)算刺激指數(shù)(stimulating index，SI)作為判斷淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化程度的指標(biāo)。
刺激組(加PHA刺激)cpm均值
刺激指數(shù)(SI) =
對(duì)照組(未加PHA刺激)cpm均值
【注意事項(xiàng)】
1．PHA在刺激淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化時(shí)有一個(gè)最適濃度，濃度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)降低淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率。
2．本試驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，故整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程應(yīng)注意無(wú)菌操作，否則因污染會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。
3．實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用的同位素，須嚴(yán)格按照同位素操作規(guī)則進(jìn)行操作，以防污染環(huán)境。
4．同位素?fù)饺敕ǖ挠绊懸蛩剌^多，如細(xì)胞濃度、PHA濃度、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)液成分及3H—TdR的活性等，故應(yīng)嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件。
【思考題】
1．試比較形態(tài)學(xué)計(jì)數(shù)法和3H—TdR摻入法進(jìn)行淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)的優(yōu)缺點(diǎn)。
2．為什么PHA能刺激人的T細(xì)胞轉(zhuǎn)化而不能刺激B細(xì)胞轉(zhuǎn)化？
實(shí)驗(yàn)四 白細(xì)胞移動(dòng)抑制試驗(yàn)
【原理】
致敏T細(xì)胞在體外與相應(yīng)抗原再次接觸或正常人的T細(xì)胞受有絲分裂原(如PHA)刺激，可產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，如巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(macrophage migrationinhibitory factor，MIF)和白細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(leucocyte migrationinhibitory factor，LIF)，可分別抑制巨噬細(xì)胞和白細(xì)胞的移動(dòng)。據(jù)選擇的指示細(xì)胞(巨噬細(xì)胞或白細(xì)胞)不同，可分為巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制試驗(yàn)和白細(xì)胞移動(dòng)抑制試驗(yàn)，以后者較為常用。原因是T細(xì)胞與其它白細(xì)胞可同時(shí)從外周血中獲得，二者不需分離，操作簡(jiǎn)便。根據(jù)白細(xì)胞的移動(dòng)受LIF抑制的程度，可判斷受檢者的細(xì)胞免疫功能。
【材料】
1．肝素抗凝血2ml。
2．毛細(xì)玻璃管 長(zhǎng)70～80mm，內(nèi)徑0.7mm，干烤滅菌。
3．培養(yǎng)小室 用玻璃板(或有機(jī)玻璃)制成，內(nèi)徑2cm，高0 .5cm。用前洗凈、晾干，置紫外燈下照射1h滅菌。
4．26×26mm滅菌蓋玻片。
5．含20%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液。
6．PHA原液濃度8mg／ml，使用時(shí)用1640培養(yǎng)液配制成1∶100和l∶500兩種濃度。(抗原則按實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌x定，常用1／10或1／100稀釋的舊結(jié)核菌素)。
7．有蓋搪瓷盤(pán)、白凡士林、小鑷子、砂輪、投影儀及分離淋巴細(xì)胞的所需器材。
【方法】
1．采用密度梯度離心法分離外周血淋巴細(xì)胞，計(jì)數(shù)收獲淋巴細(xì)胞總數(shù)。
2．制備紅細(xì)胞懸液 使其濃度達(dá)109／ml，并用紅細(xì)胞懸液調(diào)節(jié)白細(xì)胞濃度至5×106／ml(白細(xì)胞向毛細(xì)管外移動(dòng)游走時(shí)，紅細(xì)胞因其濃度大而被動(dòng)地被白細(xì)胞帶出管外，使結(jié)果更易觀察)。
3．用虹吸法將混合血細(xì)胞收入毛細(xì)管內(nèi)，吸入高度約60mm，并將玻管無(wú)細(xì)胞端用火焰封口，每一標(biāo)本共制六支毛細(xì)管。
4．將毛細(xì)管放入墊有少許棉花的試管中(毛細(xì)管開(kāi)口端向上)，于水平式離心機(jī)中離心2000rpm，20min。
5．用砂輪于上清液和細(xì)胞界面處截?cái)嗝?xì)管。
6．用鑷子夾取盛有壓積細(xì)胞的毛細(xì)管，將其封閉端用白凡土林少許粘于培養(yǎng)小室內(nèi)，并使開(kāi)口端朝向小室中央，每個(gè)小室放一支。
7．于兩個(gè)小室內(nèi)分別注滿含有1/100、l/500PHA的營(yíng)養(yǎng)液，另用不含PHA的營(yíng)養(yǎng)液注入另一個(gè)小室作為對(duì)照。試驗(yàn)組和對(duì)照組均設(shè)復(fù)管。
8．在培養(yǎng)小室邊緣涂凡士林少許，加蓋坡片封閉小室(注意不要在小室內(nèi)留有氣泡)，將小室放入濕盒，于37℃溫箱中培養(yǎng)13～24h后觀察結(jié)果。
【結(jié)果】
1．在投影儀下畫(huà)出試驗(yàn)組與對(duì)照組白細(xì)胞移動(dòng)圖象，測(cè)得白細(xì)胞移動(dòng)面積，得出各組平均值(圖3-2)。
2．計(jì)算移動(dòng)抑制指數(shù)(MI)
試驗(yàn)組細(xì)胞移動(dòng)面積均值
移動(dòng)抑制指數(shù)(MI) =
對(duì)照組細(xì)胞移動(dòng)面積均值
MI在0.8～1.2之間為正常值，表示機(jī)體對(duì)該抗原無(wú)特異性細(xì)胞免疫作用；MI<0.8，為移動(dòng)抑制試驗(yàn)陽(yáng)性反應(yīng)，表示機(jī)體對(duì)該抗原有特異性細(xì)胞免疫作用。
移動(dòng)抑制試驗(yàn)是檢測(cè)機(jī)體細(xì)胞免疫狀態(tài)的一種體外試驗(yàn)，與皮膚遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗(yàn)相關(guān)性較好，可用于腫瘤免疫、移植免疫、自身免疫性疾病和傳染性疾病等的研究。
對(duì)照組（不加PHA) 實(shí)驗(yàn)組（加PHA)
圖3-2 白細(xì)胞移動(dòng)抑制試驗(yàn)示意圖
【注意事項(xiàng)】
1．毛細(xì)管內(nèi)徑、管壁厚薄要盡量一致。
2．水平離心后，白細(xì)胞不宜放置過(guò)久，在空氣中暴露時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。
3．各管的細(xì)胞懸液高度要盡量一致。
【思考題】
1．T淋巴細(xì)胞在什么情況下產(chǎn)生LIF?檢測(cè)LIF有何實(shí)際意義?
2．致敏T細(xì)胞在特異性抗原刺激下還可產(chǎn)生哪些重要的細(xì)胞因子？
實(shí)驗(yàn)五 白細(xì)胞介素2的誘生與活性測(cè)定
一、白細(xì)胞介素2(IL-2)的誘生方法
1．常規(guī)分離PBMC，用含10%FCS RPMI 1640液調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106／ml。
2．細(xì)胞懸液加入24孔培養(yǎng)板，1ml／孔，加入PHA 125μg／孔，37℃CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h。
3．離心2000rpm，20min，收集上清液，-20℃凍存待檢。
二、IL-2的活性測(cè)定
（一)3H—TdR摻入法
【原理】
白細(xì)胞介素2(interleukin 2，IL-2)由活化Th細(xì)胞產(chǎn)生，是T細(xì)胞進(jìn)行克隆擴(kuò)增以及維持T細(xì)胞在體外生長(zhǎng)所必需的一種重要的細(xì)胞因子。檢測(cè)IL-2活性的原理是：由于T淋巴細(xì)胞在體外必須有IL-2才能生長(zhǎng)，故可選用對(duì)IL-2呈依賴(lài)性的T淋巴細(xì)胞株(如CTLL-2)進(jìn)行檢測(cè)。在CTLL-2培養(yǎng)過(guò)程中，加入待測(cè)標(biāo)本(如用PHA刺激的PBMC培養(yǎng)上清液)，如果CTLL-2得以生長(zhǎng)，表明待測(cè)標(biāo)本中含IL-2。且CTLL-2對(duì)IL-2的需求，在一定范圍內(nèi)呈劑量依賴(lài)性，因此，可以根椐CTLL-2細(xì)胞生長(zhǎng)的程度，對(duì)IL一2活性定量測(cè)定。
CTLL-2(cytotoxic T-lymphocyte line 2)是來(lái)源于C57BL／6小鼠的細(xì)胞毒T細(xì)胞系，對(duì)IL-2有依賴(lài)的特性，即只能在有IL-2存在的培養(yǎng)基中才能生長(zhǎng)，因此可作為指示細(xì)胞來(lái)測(cè)定待檢樣品中IL一2的水平。除CTLL-2外，絲裂原活化的T淋巴母細(xì)胞和小鼠胸腺細(xì)胞亦可作為檢測(cè)IL-2活性的指示細(xì)胞。
【材料】
1．檢測(cè)細(xì)胞 CTLL-2(一株小鼠來(lái)源的IL一2依賴(lài)細(xì)胞株)。
2．待測(cè)IL一2樣品 用PHA刺激的PBMC培養(yǎng)上清液。
3．已知活性為100u／ml的IL一2標(biāo)準(zhǔn)品，10%FCS RPMI1640。
4．濃度為1mci／ml的3H標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷(3H—TdR)。
5．微量細(xì)胞收集儀、液體閃爍計(jì)數(shù)器。
6．PP0(2,5-二苯基惡唑，2,5-diphenyloxazole)、POPOP[1,4雙(2’-c5’苯基惡唑)苯，1,4-di-(2’-c5’-phenyloxazolyl)-benzene]、二甲苯。
【方法】
1．制備CTLL-2細(xì)胞懸液 收集生長(zhǎng)良好的CTLL-2細(xì)胞，1500rpm，5min，用10%FCS RPMI1640洗滌細(xì)胞兩次，制成細(xì)胞懸液。取一滴用0.5%臺(tái)酚藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力(應(yīng)在95%以上)。調(diào)整細(xì)胞濃度至1×l05／ml。
2．加樣 將標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品分別作倍比稀釋。按每孔100μl加入96孔平底培養(yǎng)板中，每個(gè)稀釋度各加3個(gè)復(fù)孔。然后，每孔加入CTLL-2細(xì)胞懸液l00μl。另設(shè)3個(gè)對(duì)照孔，只加100μl細(xì)胞和100μl培養(yǎng)液，不加IL-2。加樣后，培養(yǎng)板置37℃5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24h。
3．同位素的摻入及計(jì)數(shù) 在培養(yǎng)終止前6～10h加入同位素，每孔加入lμci 3HTdR。培養(yǎng)結(jié)束后立即用微量細(xì)胞收集儀收集細(xì)胞。液體閃爍計(jì)數(shù)測(cè)定每管的cpm值。
【結(jié)果】
待測(cè)樣品cpm最大值50%所需稀釋度
IL-2活性(u／ml)= ×標(biāo)準(zhǔn)品活性
標(biāo)準(zhǔn)品cpm最大值50%所需稀釋度
3HTdR摻入法測(cè)得各孔cpm值后，可計(jì)算IL-2的活性單位。首先計(jì)算出細(xì)胞增殖強(qiáng)度R(R為IL-2孔的cpm值)，不同IL-2稀釋度時(shí)的R值不同。以IL-2稀釋度為橫坐標(biāo)，R值為縱坐標(biāo)，繪制出兩者的關(guān)系曲線，由曲線查得最大R值。然后找出50%最大R值相應(yīng)的IL-2稀釋度，稱(chēng)為1個(gè)IL-2活性單位。
例如：IL-2檢測(cè)樣品的一個(gè)活性單位為1∶32，則此樣品中含IL-2的濃度為32u/ml。若與已知單位的IL-2標(biāo)準(zhǔn)品比較，即可計(jì)算出樣品的標(biāo)準(zhǔn)單位。假設(shè)IL-2標(biāo)準(zhǔn)品為50μg/ml，在本次試驗(yàn)測(cè)得50%最大R值為1∶40；待測(cè)樣品的50%最大R值為1∶32，則其IL-2的標(biāo)準(zhǔn)單位數(shù)(N)可由下式計(jì)算：
N = 50μg/ml ×(32/40)
【注意事項(xiàng)】
1．CTLL-2在體外長(zhǎng)期維持培養(yǎng)比較困難，若條件不具備，可改用ConA激活小鼠胸腺細(xì)胞作為檢測(cè)細(xì)胞，方法類(lèi)似。
2．待測(cè)IL-2粗樣品中常含低分子量的抑制因子，可經(jīng)透析后再檢測(cè)，以提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。
3．檢測(cè)IL-2活性前需充分洗滌CTLL-2細(xì)胞，目的是除去殘留的IL-2，以免干擾檢測(cè)結(jié)果。但操作必須輕柔，離心速度不宜過(guò)高。
4．加入3HTdR的最適時(shí)機(jī)是陰性對(duì)照細(xì)胞趨于全部死亡。
5．CTLL-2細(xì)胞凍存后復(fù)蘇較困難，用含絲裂原的培養(yǎng)基長(zhǎng)期培養(yǎng)易發(fā)生變異。
6．避免同位素污染。
7．加入標(biāo)準(zhǔn)IL-2或待檢樣品時(shí)，按從低濃度到高濃度順序加入。
【思考題】
1．IL-2主要由何種細(xì)胞產(chǎn)生?檢測(cè)IL-2的活性有何實(shí)際意義?
2．為什么說(shuō)CTLL-2細(xì)胞在體外長(zhǎng)期維持培養(yǎng)比較困難？
3．簡(jiǎn)要說(shuō)明IL-2的誘生過(guò)程及其主要生物學(xué)作用。
（二)MTT比色法
【原理】
白細(xì)胞介素-2(Interleukin-2，IL-2)是由Th細(xì)胞產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子，在淋巴細(xì)胞增殖分化過(guò)程中起著非常重要的作用，而且能維持T細(xì)胞在體外長(zhǎng)期生長(zhǎng)。MTT比色法的原理是以DNA合成酶活性為指標(biāo)，檢測(cè)IL-2的活性。CTLL-2是一株IL-2依賴(lài)性T淋巴細(xì)胞株，只有在IL-2存在的條件下，CTLL-2才能增殖、分裂。細(xì)胞增殖活躍時(shí)線粒體中琥珀酸脫氫酶活性增加，該酶能使黃色的MTT氧化后形成藍(lán)色結(jié)晶狀顆粒(formazan)，藍(lán)色顆粒formazan的量與IL-2活性水平成正比，通過(guò)比色法進(jìn)行定量。
MTT比色法具有簡(jiǎn)單，快速，敏感的特點(diǎn)，在掌握良好的試驗(yàn)條件下，其敏感性可接近3HTdR摻入法，且不需要接觸同位素。
【材料】
1．PRMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液 內(nèi)含2mol／L谷氨酰胺，25mol／L HEPES，青霉素100u／m1，鏈霉素100u／ml及10%滅活小牛血清。
2．PBS-G 含0.5%葡萄糖的磷酸緩沖液(PBS)0.02mol／L，pH7.2。
3．MTT 3-[4,5-Dimethythiajol一2yl]一2,5一diphenyltetrajolium bronide，中文名為3-(4’,5’-二甲噻唑-乙基)-2,4-二苯四唑嗅鹽，用PBS-G配成1mg／ml使用液，4℃避光。
4．DMSO(二甲基亞砜)。
5．IL-2標(biāo)準(zhǔn)品 活性為500u／m1。
6．CTLL-2 一株來(lái)源于小鼠的IL一2依賴(lài)細(xì)胞株。
【方法】
1．制備CTLL一2細(xì)胞懸液 收集生長(zhǎng)良好的CTLL-2細(xì)胞，用RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞兩次，1500rpm，5min。然后制成細(xì)胞懸液，用0.5%臺(tái)酚藍(lán)液染色檢測(cè)細(xì)胞存活率(應(yīng)在95%以上)，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105／ml。
2．加樣 將標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣品作倍比稀釋?zhuān)疵靠?00μl加入96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個(gè)稀釋度三個(gè)復(fù)孔。然后，每孔加CTLL-2細(xì)胞懸液100μl。另設(shè)三個(gè)對(duì)照孔，只加100μl細(xì)胞和100μl培養(yǎng)液，37℃5%CO2條件下培養(yǎng)32～40h。輕輕吸棄上清液l00μl，加入MTT溶液(1mg／ml)50μl。于振蕩器上振蕩1min，放置37℃、5%CO2孵育箱內(nèi)反應(yīng)2h。取出培養(yǎng)板，2000rpm，5min，吸棄上清液，每孔加入DMS0 120μl，振蕩30s后，在酶標(biāo)儀540nm處讀取OD值。
【結(jié)果】
待測(cè)樣品OD值最大值的50%所需稀釋度
IL-2活性(u／ml) = ×標(biāo)準(zhǔn)品活性
標(biāo)準(zhǔn)品OD值最大值的50%所需稀釋度
【注意事項(xiàng)】
1．檢測(cè)IL-2活性前需充分洗滌CTLL-2細(xì)胞，目的是除去殘留的IL-2，以免干擾檢測(cè)結(jié)果。但操作必須輕柔，離心速度不宜過(guò)高。
2．具體計(jì)算方法可參照3HTdR摻入法的結(jié)果計(jì)算舉例。
【思考題】
1．試述MTT比色法和3HTdR摻入法檢測(cè)IL-2活性的優(yōu)缺點(diǎn)。
2．MTT比色法檢測(cè)IL-2活性的原理是什么？可否把MTT比色法用于淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)？
3．檢測(cè)IL-2的生物活性與采用ELISA法檢測(cè)血清中IL-2水平的臨床意義有何不同？
實(shí)驗(yàn)六 CTL殺傷功能測(cè)定——51Cr釋放法
【原理】
細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic T Lymphocyte，CTL)對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用具有特異性，即由某種抗原致敏的CTL，只對(duì)帶有相同抗原的靶細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用。如單向MLR誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL，在殺傷靶細(xì)胞時(shí) ，必須識(shí)別相應(yīng)的同種異型抗原，并受到MHC的限制。CTL的殺傷功能常采用51Cr釋放試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)用同位素鉻酸鈉(Na251CrO4)標(biāo)記靶細(xì)胞時(shí)，鉻酸鹽離子(51CrO42-)以滲透方式進(jìn)入細(xì)胞漿并與細(xì)胞漿內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)合。當(dāng)這種細(xì)胞被效應(yīng)細(xì)胞殺傷后，胞漿內(nèi)51Cr從細(xì)胞膜損傷或裂解處釋放出來(lái)，測(cè)定所釋放的同位素量可反映CTL殺傷作用的強(qiáng)度。
【材料】
1．動(dòng)物 不同H-2的近交系小鼠。
2．靶細(xì)胞 已知H-2的瘤株，如P815(H-2d)。
3．試劑 Na251CrO4溶液，比活性250～500mci／mmol，濃度l mci／ml(英國(guó)Amersham)或28mci／ml(北京原子能所)。2.5%Triton X-100、0 .5%臺(tái)酚藍(lán)染液、絲裂霉素C、Tris-氯化銨溶液(溶解小鼠脾細(xì)胞中夾雜的紅細(xì)胞)。完全培養(yǎng)液(CM)、BSS／10(含10%小牛血清的平衡鹽溶液)。
4．器材 培養(yǎng)瓶、玻璃滴管、離心管、試管架、血球計(jì)數(shù)板、定量加樣器及加樣塑料頭、青霉素瓶、96孔微量細(xì)胞培養(yǎng)板(圓底或平底)。倒置及光學(xué)顯徽鏡、水平式離心機(jī)及盛放96孔培養(yǎng)板的離心用吊藍(lán)、γ計(jì)數(shù)儀(瑞典LKB公司)、CO2培養(yǎng)箱。
【方法】
1．效應(yīng)細(xì)胞的制備
用單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)生CTL。按常規(guī)方法制備反應(yīng)細(xì)胞(除去紅細(xì)胞的甲小鼠脾細(xì)胞)。刺激細(xì)胞按下面步驟制備：選擇H-2與甲鼠不同的乙品系小鼠，制備除去紅細(xì)胞的脾細(xì)胞懸液，置于25m1培養(yǎng)方瓶?jī)?nèi)，平臥接受60鈷2.000rad γ射線照射。以CM洗滌一次后，調(diào)整細(xì)胞至所需濃度；或用25μg絲裂霉素C／l×107脾細(xì)胞／ml濃度處理，經(jīng)37℃、水浴30min后，依次用BSS／10洗滌二次和CM洗滌一次后，調(diào)整細(xì)胞至所需濃度。用臺(tái)酚藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力，要求活細(xì)胞>90%。
將2×107反應(yīng)細(xì)胞(甲小鼠脾細(xì)胞)與2×107刺激細(xì)胞(γ射線照射或絲裂霉素C處理的乙小鼠脾細(xì)胞)混于20ml CM中，加入體積為50ml培養(yǎng)方瓶?jī)?nèi)(底面積2×4cm2，液面高3cm)。輕輕旋上瓶蓋，并設(shè)單純反應(yīng)細(xì)胞或刺激細(xì)胞的對(duì)照瓶。在37℃、飽和濕度、5%CO2條件的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4d或5d。
2．靶細(xì)胞的制備 醫(yī).學(xué)全在線
若在MLC中誘導(dǎo)的是H-2d抗原特異性的CTL，可采用DBA／2小鼠肥大細(xì)胞瘤株P(guān)815(H-2d)為靶細(xì)胞。同位素標(biāo)記靶細(xì)胞的方法是先常規(guī)培養(yǎng)P815細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)前一天換上新鮮培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)當(dāng)天檢測(cè)細(xì)胞活力需大于95%。然后，取2×106／0.5ml P815細(xì)胞加入100μci Na251Cr04，37℃水浴2h，結(jié)束后洗滌3次，調(diào)整細(xì)胞濃度至l×105／ml。
3．細(xì)胞毒試驗(yàn)
收集效應(yīng)細(xì)胞入離心管內(nèi)，取離心后細(xì)胞沉淀部分，用CM調(diào)節(jié)活細(xì)胞濃度至l.0×107／m1，并可根據(jù)不同效靶比例要求，對(duì)倍稀釋成5×106／ml、2．5×106／ml、1.25×106／ml細(xì)胞懸液。然后在96孔板中加入1×104／0.1ml的標(biāo)記細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)孔加入不同比例的效應(yīng)細(xì)胞0.1ml，自然釋放孔加入0.1ml CM，最大釋放孔加入0.lml 2.5%TritonX-100，每組3～4個(gè)復(fù)孔。再經(jīng)500rpm，30s離心，使效、靶細(xì)胞接觸，然后置CO2培養(yǎng)箱內(nèi)溫育4～6h，最后經(jīng)1000～1500rpm，5～10min離心沉淀，依次吸出每孔中上清液0.1ml置于小塑料管內(nèi)蓋緊，在γ計(jì)數(shù)儀上進(jìn)行測(cè)定。
【結(jié)果】
分別計(jì)算實(shí)驗(yàn)組、自然釋放組及最大釋放組cpm，按下列公式進(jìn)行計(jì)算
實(shí)驗(yàn)組cpm – 自然釋放組cpm
51Cr特異性釋放率 = ×100
最大釋放組cpm – 自然釋放組cpm
四小時(shí)自然釋放率>10%～15%
最大釋放率通常>90%
特異性釋放率隨效／靶比例6.25∶l、12.5∶1、25∶l、50∶1和100∶l而遞增，兩者間常呈相關(guān)性。由于CTL特異性殺傷力強(qiáng)，一般采用的效／靶比例為50∶1。
【注意事項(xiàng)】
1．細(xì)胞活力大小是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵，故操作時(shí)動(dòng)作要迅速。培養(yǎng)過(guò)程使pH恒定在7.2～7.4之間。
2．靶細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期標(biāo)記率高。為此，實(shí)驗(yàn)前一天務(wù)必?fù)Q液，確保細(xì)胞生長(zhǎng)良好。在靶細(xì)胞標(biāo)記過(guò)程中，由于51Cr進(jìn)入靶細(xì)胞漿內(nèi)，細(xì)胞脆性增大，因此震蕩動(dòng)作要輕揉。
3．51Cr自然釋放率常隨效靶細(xì)胞作用時(shí)間延長(zhǎng)而偏高，如作用時(shí)間為18h，自然釋放率可高于20%，故宜做短程試驗(yàn)；51Cr半衰期短，存放時(shí)間最好不要超過(guò)2個(gè)半衰期，否則標(biāo)記率低，自然釋放率高。
4．國(guó)產(chǎn)51Cr比活性低，欲達(dá)到要求的放射強(qiáng)度，務(wù)必加大51Cr用量，這就不可避免地增加了鉻含量，造成對(duì)靶細(xì)胞損傷，致4h自然釋放率往往超過(guò)允許范圍(>15%)。此時(shí)只能中止實(shí)驗(yàn)。
5．經(jīng)單向MLR后，培養(yǎng)物中包含不少死細(xì)胞，有條件可采用20%Metrizamide分離去之。
【思考題】
1．CTL殺傷靶細(xì)胞的機(jī)制是什么？與補(bǔ)體的溶細(xì)胞機(jī)制有何區(qū)別？
2．怎樣理解CTL殺傷靶細(xì)胞時(shí)的抗原特異性和MHC限制性？
3．如欲檢查某種腫瘤抗原或免疫原性治療藥物與CTL殺傷功能的關(guān)系，怎樣設(shè)計(jì)試驗(yàn)？
