三、SPA在免疫細胞化學染色中的應用
SPA可為多種示蹤物如熒光素、酶、膠體金、鐵蛋白等所標記，應用較廣的為酶標記SPA和金標記SPA技術，后者將在第七章 中敘述。標記SPA常用的酶為HRP�？蓱糜陂g接法。SPA在PAP法中可代替橋抗體。
1．SPA—HRP用于間接法的操作步驟
�。�1)切片經脫蠟后用0.5%H2O2—純甲醇液處理5min以抑制內源性過氧化物酶活性。
�。�2)用Tris鹽酸緩沖液（0.05mol/l pH7.6)洗2次，每次3min。
（3)以第一抗體血清覆蓋處理切片，37℃，孵育30min，或4℃24～48h。
（4)用Tris-HCl緩沖液洗3次，每次5min。
�。�5)加SPA—HRP（1：100～1：400)處理30min。
�。�6)Tris-HCl緩沖液洗3次，每次5min。
�。�7)DAB—H2O2顯色。
�。�8)復染、脫水、透明、封固。反應物為棕色。
2．SPA用于PAP法的操作步驟
�。�1)切片脫蠟至水洗。
�。�2)80%甲醇（含0.6%H2O2)封閉內源酶活性5min。
�。�3)10%卵白蛋白Tris緩沖液，20min。
�。�4)第一抗體作用37℃，30min或4℃ ，16～48h。
�。�5)0.05mol/l pH7.6 Tris-HCl緩沖鹽液洗片5min。
�。�6)SPA（1μg/ml)5min。
（7)Tris-HCl鹽液洗5min。
�。�8)PAP復合物（無種屬限制)，5min。
（9)Tris-HCl鹽液洗切片5min。
（10)DAB（0.6mg/ml)，加0.01%H2O2反應5min，然后水洗。
（11)復染：常用Mayer’s蘇木精液數(shù)秒至1min（視需要而定)，水洗。
（12)脫水、透明、封固、鏡檢。
3．SPA—HRP的制備 應用Nakane和Kawaoi1974年建立的過碘酸法，酶：SPA=2：1，即HRP10mg,SPA5mg。
�。�1)10mg 溶于新鮮配制的pH8.1、0.3mol/L碳酸氫鈉溶液1ml，加入0.1ml 1%二硝基氟苯無水乙醇溶液以封閉酶分子中的氨基，使不發(fā)生酶的自身聚合，室溫輕輕攪拌1h。
�。�2)加入1ml0.04～0.08mol/L（依不同批號的酶而定)的NaIO4，室溫攪拌30min。
（3)加入1ml0.16mol/L乙二醇，室溫輕攪1h。
�。�4)對1000ml 0.01mol/L pH95 碳酸鹽緩沖液充分透析（4℃，過夜)，換緩沖液3次。
�。�5)加入5mg SPA的0.1mol/l pH7.4碳酸鈉緩沖液1ml，室溫輕攪2～3h。
�。�6)加5mg硼氫化鈉（NaBH4)終止氧化，置4℃冰箱3h或過夜。
（7)對PBS透析24h，4℃離心去沉淀，半飽和硫酸銨洗沉淀結合物3次，溶于1ml 0.02mol/L pH7.4的PBS中。
�。�8)對PBS充分透析，經測定后分裝，貯于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/P>
用過碘酸鈉法可以得到很高標記率的HRP-SPA標記物，而且保存了抗體的全部活性，敏感度高，穩(wěn)定性強，大大優(yōu)于戊二醛標記抗體法，國內現(xiàn)在也有HRP-SPA的標記物供應，但要注意由于各家所用的SPA可能來源于不同菌株，在性質上可能存在一些差異。
【注意事項】
�、僭谑褂枚趸胶�，會產生氟化氫，應充分透析除凈，否則抑制酶活性。
�、跇擞洉r過碘酸濃度不宜過高，氧化時間不宜過長，否則會產生過度標記，即多個酶分子結合到一個蛋白A分子上。這些過度標記蛋白A的免疫反應性很差，容易產生非特異性染色。
�、蹣擞洉r加入酶與SPA的比例應適合，比值過大易產生過度標記，比值小則標記蛋白A產率低。
④過碘酸氧化結果能使酶具有多個醛基，從而能與多個蛋白分子的氨基相結合，成為一些大分子的聚合物。因此，有作者強調指出，對要求具有較強的細胞穿透力的免疫細胞化學實驗時應予以考慮是否適用。但國內有實驗室應用上海生物制品所產生的應用過碘酸氧化法制備的HRP—SPA于免疫電鏡研究仍獲得了較為滿意的結果。
