二、影響DNA提取質(zhì)量的因素
1．固定劑對DNA的影響固定劑的類型直接影響提取DNA的質(zhì)量。目前大多數(shù)實驗室常用的中性緩沖福爾馬林固定的標本，DNA保存完好，可以獲得高分子量DNA。Warford等（1988)對甲醛固定過程中DNA變化進行了觀察，發(fā)現(xiàn)核酸對甲醛反應性可分為兩個階段：①早期出現(xiàn)堿基快速可逆性羥甲基化；②數(shù)天后堿基對間核酸與蛋白間緩慢地形成亞甲基交聯(lián)。DNA提取過程中的蛋白酶K消化，酚/氯仿抽提和純化等步驟，可以消除由于固定所造成的DNA某些理化性質(zhì)改變。
bramwell等（1988)發(fā)現(xiàn)，甲醛和戊二醛固定可使得DNA產(chǎn)量降低，醋酸甲醇（MAA)可導致DNA明顯降解。Michel’s運輸保存液或PBS存放組織雖提取DNA純度高，但產(chǎn)量明顯降低。Dubeau等也觀察到含苦味酸（Bouin氏液)和含氯化汞的固定液（Zenker,Bs)處理標本不能獲得完整的DNA。
乙醇被認為是保存核酸的最佳固定劑。Wu等（1990)用無水乙醇固定標本48h，最長達2年，均可得到中量的高分子DNA。每mm3乙醇固定標本平均DNA產(chǎn)量為26.6μg,高于新鮮標本（19.4μg/mm3)。經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后，乙醇固定組織DNA均顯示由于重復DNA序列存在所產(chǎn)生的特征性衛(wèi)星帶，說明DNA被完成消化。Southern印跡雜交結果與冰凍組織一致。
Sato 等（1990)用AMex方法處理組織，既可保存許多抗原成分，亦可使大分子量DNA完好無損。其基本方法為：將組織放至4℃丙酮浸透，移至-20℃過夜。然而再用丙酮分別在4℃和室溫脫水各15min，苯甲酸透明兩次，每次15min，最后60℃真空浸蠟2～3h，石蠟包埋。結果顯示，每10mg AMex法處理的濕重組織提高分子量DNA71.4±14.53μg，與新鮮組織產(chǎn)量相當（70.4±13.76μg)。酶切、電泳和雜交反應亦相同于新鮮組織。提示AMex法是一種多用途組織處理技術，可以克服由于DNA降解、高分子量DNA減少和內(nèi)切酶不完全消化所產(chǎn)生的電泳類型改變，是一種理想的DNA保存方法，特別適用于對形態(tài)學、免疫表型和基因改變的相關性分析。
2．固定時間對DNA的影響固定過程中所發(fā)生的組織反應至今尚未被完全更理解，雖然理論上講室溫下福爾馬林與DNA幾乎不發(fā)生反應，但已發(fā)現(xiàn)堿基與組蛋白之間的甲基交聯(lián)。這種福爾馬林介導的甲基化直接影響DNA提取的效率。如果事實果真如此，那么固定的時間是一個重要的變異因素。然而，Goelz等沒有發(fā)現(xiàn)固定時間對DNA提取質(zhì)量的明顯影響。Dubeau等認為組織固定時間太短或太長均會導致DNA的降解。該作者對固定12h到5天不同時間間隔標本的DNA提取顯示，隨著固定時間的延長，可螺旋化（Spoolable)的高分子量DNA明顯減少。固定5天后可螺旋化DNA提取率僅有8%。Warford等也發(fā)現(xiàn)單細胞懸液經(jīng)30min福爾馬林固定后，DNA產(chǎn)量減少到30%，由此可見，不同標本對不同固定劑所需的最佳固定時間應摸索選定。根據(jù)Dubeau等經(jīng)驗，常規(guī)組織固定應在12h以上至110之內(nèi)。醫(yī)學全.在線網(wǎng).站.提供
3．固定溫度等其他因素對DNA的影響核酸與固定劑的反應由反應成分、濃度、酸鹼度以及溫度等因素的調(diào)節(jié) ，其中溫度效應顯得特別重要。室溫下DNA雙股螺旋鏈表現(xiàn)為兩條由氫鍵連接在互補多聚核苷酸；加熱到65℃時，氫鍵開始斷裂；約90℃時，產(chǎn)生兩條單鏈分子。在此變性狀態(tài)下，甲醛與酸反應很快，通過羥甲基化作用可抑制DNA冷卻后的再復性。
最近，Koshiba等發(fā)現(xiàn)福爾馬林固定過程中的DNA降解，是由于固定溫度高，pH低以及甲酸的存在所致。通過應用緩沖福爾馬林和低溫下固定（4℃)，可以明顯改善DNA保存。
酸性環(huán)境中DNA的降解已有過深入的研究。一般認為，強酸可導致DNA的完全解聚，而弱酸也能引起一些結構的改變。當pH達到2.5以下時，幾乎所有的堿基之間氫鍵解離，使DNA雙鏈斷裂而產(chǎn)生不可逆的變性；隨后出現(xiàn)N-糖苷鍵水解，使嘌呤殘基游離；最后，多聚核苷之磷酯鍵緩慢水解，僅殘留具有完整嘧啶的多聚脫氧核糖短臂。上述改變亦受溫度或離子強度的影響。加入鹽或降低溫度可穩(wěn)定氫鍵，因而可防止酸性條件下的DNA變性。然而，即使福爾馬林被氫氧化鈉中和，在室溫下DNA亦發(fā)生降解，提示福爾馬林本身即可降解DNA。福爾馬林中DNA降解的機理及其預防有待于進一步研究。
4．組織處理過程對DNA的影響我們發(fā)現(xiàn)，從常規(guī)組織處理的蠟塊中提取的DNA，其大部分分子量在100bp～1000bp之間，主要分布于100～1500bp，僅約1/3的組織所提取DNA>20kb。這除與固定劑、固定時間等因素有關外，可能的原因還有：①組織從外科切除到固定之間的時間長短不一。當組織未固定或固定不充分時，核酸酶可自由作用；②不同腫瘤中核酸酶的水平不一，其在固定前或固定后均不發(fā)揮作用；③蠟塊貯存的時間長短不一。雖然從不同貯存時間的蠟塊中提取的DNA大小無絕對區(qū)別，但新近的蠟塊比貯存10年以上的標本所獲得的DNA分子量大�？赡芟瀴K中仍存在導致DNA降解的因素。
組織的浸蠟和包埋溫度過高或時間過長，均可導致DNA變性，而產(chǎn)生單鏈DNA片段。單鏈DNA不能被限制性內(nèi)切酶所消化，可導致電泳時泳動速率變慢。
三、提高DNA提取質(zhì)量的方法
1．蠟塊的選擇從福爾馬林固定的組織標本中未能提出完整的高分子量DNA的重要原因之一，是應用了固定不充分的組織。因此，在DNA提取前應檢查組織切片。如果有自溶、退變或組織結構不清，大片出血等改變的蠟塊不能用；若有明顯壞死存在的蠟塊，最好不用或將壞死部分切去后再用。盡可能地選用新近標本，緩沖福爾馬林、丙酮和乙醇固定者最佳。
2．DNA提取方法學的改善為了提高石蠟包埋組織DNA提取的質(zhì)量和效益，人們從不同方面進行了探索。其中在DNA提取液的改良，蛋白酶的消化時間和DNA純化等問題上取得了進展。①DNA提取液主要含SDS和蛋白酶K的TE緩沖液。固定和包埋組織由于化學修飾作用，使得DAN與蛋白質(zhì)不易分離。因此，必須增加SDS和蛋白酶K的濃度和作用時間：SDS可增至1%～2%，蛋白酶K200～500μg/ml，最高可達1mg/ml；作用時間一般為2～4天，最長可達7天。蛋白酶K可分次加入，并注意不時震搖，使酶與組織充分接觸。Koshiba等發(fā)現(xiàn)，利用Goelz等和Dubeau等提出的DNA提取方法，不能夠得到令人滿意的完整DNA。尿素和胍（guanidine)是DNA自然和人工交聯(lián)最有力的剝脫劑，2-巰基乙醇可干擾二硫鍵，促進蛋白變性。作者對DNA提取液進行了改良，加入高濃度（4mol/L)尿素和2-巰基乙醇。應用此緩沖液，有效地從包埋組織中獲得高質(zhì)量DNA。②DNA釋放率對于不同的組織類型是有差異的，取決于組織細胞密度和細胞外間質(zhì)的多少。對于細胞豐富、含有很少間質(zhì)的組織（例如脾臟)，通過24h孵育80%以上DNA可釋放出來；相同量的DNA釋放對于富含致密間質(zhì)的子宮肌瘤則需要6天時間；轉移性畸胎瘤含中等細胞密度和疏松的間質(zhì)，DNA釋放率亦為中等。由此可見，對不同類型的組織DNA提取，蛋白酶K的孵育時間可作適當調(diào)整，以求最大量地獲取大分子DNA。此外，對于Dubeau等提出的DNA提取過程中分次消化步驟的必要性，也有人提出異議。因為低、中分子量的核酸存在對限制性內(nèi)切酶的消化和雜交不起作用。③Dubeau等發(fā)現(xiàn)，不適于進行酶切反應和雜交研究的化學修飾的DNA，可通過攪起完整的DNA而被動除去，因而強調(diào)了螺旋化（spooling)在DNA純化中的重要性。該作者還發(fā)現(xiàn)延長組織固定時間的影響之一就是減少了可螺旋化DNA的量，雜交分析顯示，螺旋化DNA雜交信號強，而未螺旋化DNA信號減弱。因此，增加DNA螺旋化可提高提取DNA質(zhì)量和雜交效率。但是，Moerkert 等認為未螺旋化DNA不影響進行點雜交分析。
3．避免DNA機械性損傷福爾馬林固定和石蠟包埋使組織變得堅韌，很難達到勻漿的效果。經(jīng)常的做法是將組織切成3～5μm薄片，使每一細胞都被切開。但是，我們認為切片太薄，容易過多地將DNA切斷，影響高分子量DNA的獲得率。最好是采用15～20μm的厚切片。高濃度蛋白酶K消化2～4天，使能達到細胞充分破碎、蛋白充分消化的目的。并盡可能避免機械性勻漿過程造成的DNA剪切。
此外，在NDA釋放出來以后的提取過程中，應盡可能輕柔操作，避免過多地移管。若必需移管時應選用大口吸管。盡可能避免人為的DNA剪切。純化DNA用TE（pH8.0)溶解放4℃保存即可，若短期不用時應-20℃凍存，但切忌反復凍融，以免DNA降解。
