�。�4)靶DNA變性：將載片浸入70℃變性溶液（70%甲酰胺，2×SSC)2min。新鮮的變性溶液需每周配制，貯存于4℃冰箱中備用。一張?zhí)幱谑覝氐妮d片放入50ml的染色缸（coplin jar)內(nèi)，將會使溶液溫度減低約1℃，因此，每次應(yīng)加入少量玻片，以免影響溶液的溫度致變性不完全。冷卻變性處理后的載片可放在冰上或浸入70%酒精溶液1min。漂洗加震動以終止反應(yīng)和徹底去除變性溶液。然后經(jīng)梯度酒精脫水（80%，90%，100%)，空氣干燥。
�。�5)雜交液的準(zhǔn)備
MM1 甲酰胺5.0ml
硫酸葡聚糖1.0g
20×SSC 1.0ml
�。ɑ�50%硫酸葡聚糖)2.0ml
MM2 甲酰胺 5.5ml
硫酸葡聚糖1 .0gm
20×SSC 0.5ml
首先將溶液在70℃加溫，以溶解硫酸葡聚糖，冷卻后調(diào)整pH至7.0,容量加至70ml。這容量是最后應(yīng)用的雜交混合液的70%，其余的30%為核酸探針和水（如果需要的話)。MM1給預(yù)雜交混合液是：50%甲酰胺，10%硫酸葡聚糖2×SSC。Trask發(fā)現(xiàn)MM2效果較MM1好，DNA的Tm比MM1低-8℃。在2×2cm區(qū)域雜交混合液應(yīng)為：MM17μl，DNA探針（保存液為500μg～10mg/ml)1μl，加探針混合液2μl，總量為10μl。
�。�6)雜交：每張蓋玻片加10μl雜交混合液，注意移除氣泡，可在蓋片四周加橡皮泥封固，在37℃濕盒中過夜。
�。�7)漂洗：從溫箱中取出后，以鑷子移除橡皮泥，從現(xiàn)在起注意勿使載片干燥。否則鹽的晶體將產(chǎn)生非特異性背景染色，漂洗應(yīng)用2×SSC（pH7)在45℃3min×3。不時震動以助徹底漂洗，蓋玻片將在漂洗中自然移除。然后再在2×SSC，45℃，2min×3。保存載片于PBS溶液內(nèi)。
�。�8)熒光顯示：
①生物素標(biāo)記DNA探針的熒光顯示。
1)應(yīng)用PBS含5%無脂干奶（5μl每張蓋片)，也可用1%牛血清白蛋白（BSA)-PBS覆蓋孵育5min室溫，以封閉非特異性結(jié)合部位。
2)移除多余液體，加抗生素-FITC（5μg/ml在PBS含5%奶粉或1%BSA，5μl/cm2)。在濕盒中，室溫孵育20min�？股锼�-FITC在此應(yīng)用是過量的，因此，可回收貯存4℃再次應(yīng)用，其保存時間可達(dá)數(shù)周。反應(yīng)見圖20-4A直接法。
3)漂洗：PBs 2min×3，45℃。
4)如需放大（amplification),即提高其敏感度，可按圖20-4B間接法加生物素化羊抗抗生物素抗血清（biotinylated goat – antivaidin antibody)30min室溫。傾去加另一層抗生物素-FITC抗血清孵育20min，重復(fù)上述1)～3)。
�、贏AF標(biāo)記核酸探針的熒光顯示
1)封閉非特異性結(jié)合部位：從PBS中取出載片，吸干多余液體，加PBS-0.1%吐溫（Tween)含2%正常羊血清（NGS)（5μl/每cm2蓋玻片)。使載片停留在室溫5min。2)傾去多余液體，加抗-AAF抗血清1：750，PBS-Tween –NGS溶液（如上i)5μl/cm2蓋玻片。室溫37℃。孵育30min.
3)漂洗：PBS-0.1%Tween室溫5min×3，間歇性振蕩。
4)羊抗小鼠IgG-FITC孵育，1：300～1：1000在PBS-0.1%Tween含2%NGS，37℃孵育30min，如3)應(yīng)用PBS-0.1%Tween 漂洗5min×3。
4．熒光標(biāo)記DNA探針在細(xì)胞核混懸液雜交中的應(yīng)用
（1)細(xì)胞核的分離：將培養(yǎng)的細(xì)胞制成細(xì)胞混懸液，或以胰蛋白酶消化法于培養(yǎng)蓋上收集培養(yǎng)細(xì)胞。應(yīng)用MgSO4染色分離方法分離細(xì)胞核（Van den Engh et al 1986, 在Traok和Van Den Engh 34章 )。細(xì)胞混懸液濃度為5×106/ml。利用RNA酶消化后，使核從細(xì)胞分離，細(xì)胞核混懸液濃度為4～5×106細(xì)胞核/ml。
�。�2)細(xì)胞固定和酸的處理：在5ml試管內(nèi)加冷的100%酒精不斷旋轉(zhuǎn)以達(dá)到滿意的固定。在冰上停留10min。在4℃離心（×150g)10min。重復(fù)加三次冷的100%酒精入試管內(nèi)，離心，傾去。置于冰上10min，再離心。然后加入相當(dāng)核懸液1/2量的0.1n HCl , 0.5% Triton X-100。室溫停留10min。加入IBM-0.25%Triton X-100（IBM配方：50mmol/l KCl, 10mmol/L MgSO4, 5mmol/L HEPES pH8.0)。再離心，重復(fù)IBM漂洗（這時細(xì)胞核可在不染色情況下，以熒光顯微鏡觀察)后，以2×SSC-0.1%Tween漂洗1×3min，繼之加入等量2%的多聚甲醛在1×PBS-5mmol/l MgSO4。在室溫靜置站立10min。傾去上清液，加IBm -Triton X-100漂洗，離心，使細(xì)胞核混懸液最終濃度為108/ml，（可用IBM-Triton X-100稀釋約50倍，在血球計數(shù)器計數(shù))，混懸液鏡檢應(yīng)含單個，完整的細(xì)胞核。
�。�3)細(xì)胞核混懸液雜交
①配制雜交混合液：甲酰胺5份，20×SSC1份，50%硫酸葡聚糖2份，pH調(diào)至7.0。此原液（stock solution)可貯存在4℃冰箱內(nèi)。應(yīng)用時加1份10mg/ml鯡魚精子DNA（herring sperm DNA)。
�、诨旌�1μl的細(xì)胞核混懸液（108/ml)與18μl的雜交混合液，充分混勻。將此19μl混合液移入1.5ml容積的Eppendorf 管中（核含量約為105)。
③加入100ng/每管的AAF標(biāo)記DNA探針（如為生物素標(biāo)記DNA探針濃度為20～40ng/每管)。
④置70℃10min使DNA探針和核DNA變性。
�、莺徒M織切片與DNA探針雜交方法相較，不同的是在加熱變性后切勿置冰上迅速冷卻以終止反應(yīng)，而應(yīng)迅速轉(zhuǎn)入37℃孵育過夜。
