第二節(jié) DNA的損傷及修復
DNA的損傷，《羅紀盛》P428
一些物理化學因子如紫外線、電離輻射和化學誘變劑均可引起DNA損傷，破壞其結構與功能。然而在一定條件下，生物機體能使這種損傷得到修復。
紫外線可使DNA分子中同一條鏈上兩個相鄰的胸腺嘧啶堿基之間形成二聚體（TT)，兩個T以共價鍵形成環(huán)丁烷結構。CT、CC間也可形成少量二聚體（CT、CC)，使復制、轉錄受阻。
P346圖19-22
細胞內(nèi)具有一系列起修復作用的酶系統(tǒng)，可以除去DNA上的損傷，恢復DNA的雙螺旋結構。目前已知有4種酶修復系統(tǒng)：光復活、切除修復、重組修復、SOS反應誘導的修復，后三種不需要光，又稱為暗修復。
一、 直接修復
1949年已發(fā)現(xiàn)光復活現(xiàn)象，可見光（最有效400nm)可激活光復活酶，此酶能分解由于紫外線形成的嘧啶二聚體。高等哺乳動物沒有此酶。
P347 圖19-23 紫外線損傷的光復活過程
A 形成嘧啶二聚體 B. 光復合酶結合于損傷部位 C 酶被可見光激活 D. 修復后釋放酶
二、 切除修復
P348 圖19-24 DNA損傷的切除修復過程
在一系列酶的作用下，將DNA分子中受損傷部分切除，并以完整的那一條鏈為模板，合成出切去部分，DNA恢復正常結構。
I、結構缺陷的修復：
（1)核酸內(nèi)切酶識別DNA損傷部位，在其附近將其切開。
（2)核酸外切酶切除損傷的DNA。
（3)DNA聚合酶修復。
（4)DNA連接酶連接。
圖
II、無嘌呤無嘧啶——堿基缺陷或錯配——脫堿基（N-糖苷酶)：
甲基磺酸甲酯可使鳥嘌呤第7位氮原子烷基化，活化β—糖苷鍵，造成脫嘌呤作用；酸也能使DNA脫嘌呤。
DNA復制時，DNA聚合酶對dTTP和dUTP分辨力不高，有少量dUTP摻入DNA鏈。細胞中的尿嘧啶-N-糖苷酶可以切掉尿嘧啶。腺嘌呤脫氨形成次黃嘌呤時也可以被次黃嘌呤-N-糖苷酶切掉次黃嘌呤。
對于無嘌呤無嘧啶的損傷有兩種修復方法：
（1) AP核酸內(nèi)切酶切開，核酸外切酶切除，DNA聚合酶修復，DNA連接酶連接。
（2) 插入酶插入正確堿基三、 重組修復
P349圖19—25重組修復的過程
切除修復發(fā)生在DNA復制之前，而當DNA發(fā)動復制時尚未修復的損傷部位，可以先復制，再重組修復。
在重組修復過程中，DNA鏈的損傷并未除去。
重組修復至少需要4種酶組分。
重組基因recA編碼一種分子量為40000的蛋白質，它具有交換DNA鏈的活力。RecA蛋白被認為在DNA重組和重組修復中均起關鍵作用。
recB、recC基因分別編碼核酸外切酶V的兩個亞基。
此外，修復合成還需要DNA聚合酶和連接酶。
四、 易錯修復和應急反應（SOS反應)
誘導修復是細胞DNA受到嚴重損傷或DNA復制系統(tǒng)受到抑制的緊急情況下，為求得生存而出現(xiàn)的一系列誘導性修復。
SOS反應誘導的修復系統(tǒng)包括避免差錯的修復（無差錯修復)和傾向差錯的修復。
避免差錯的修復：SOS反應能誘導光復活切除修復和重組修復中某些關鍵酶和蛋白質的產(chǎn)生，從而加強光復活切除修復和重組修復的能力，這屬于避免差錯的修復。
傾向差錯的修復：SOS反應還能誘導產(chǎn)生缺乏校對功能的DNA聚合酶，它能在DNA損傷部位進行復制而避免了死亡，可是卻帶來了高的突變率，這屬于傾向差錯的修復。
SOS反應是由RecA蛋白和LexA阻遏物相互作用引起的。RecA蛋白不僅在同源重組中起重要作用，而且它也是SOS反應的最初發(fā)動因子。在有單鏈DNA和ATP存在時，RecA蛋白被激活而表現(xiàn)出蛋白水解酶的活力，它能分解λ噬菌體的阻遏蛋白和LexA蛋白。LexA蛋白（22Kd)許多基因的阻遏物，當它被RecA的蛋白水解酶分解后就可以使一系列基因得到表達其中包括紫外線損傷的修復基因uvrA、uvrB、uvrC（分別編碼核酸內(nèi)切酶的亞基)以及recA和lexA基因本身，還有單鏈結合蛋白基因ssb，與λ噬菌體DNA整合有關的基因himA、與誘變作用有關的基因umuDC，與細胞分裂有關的基因sulA，ruv，和lon，以及一些功能不清楚的基因dinA，B，D，F(xiàn)等。
SOS反應廣泛存在于原核生物和真核生物，它是生物在極為不利的環(huán)境中求得生存的一種基本功能。
然而癌變有可能也是通過SOS反應造成的，因為能引起SOS反應的作用劑通常都具有致癌作用，如X-射線，紫外線，烷化劑，黃曲霉素等，而某些不能致癌的誘變劑并不引起SOS反應，如5-溴尿嘧啶。目前，有關致癌物的一些簡便檢測方法就是根據(jù)SOS反應原理而設計的，既測定細菌的SOS反應。
第三節(jié) RNA指導的DNA合成（反轉錄)
反轉錄（reverse transcription)：以RNA為模板，合成DNA。與通常轉錄過程中遺傳信息流從DNA到RNA的方向相反。
1970年，Temin 和Baltimore分別從致癌RNA病毒（勞氏肉瘤病毒和鼠白血病病毒)中發(fā)現(xiàn)發(fā)反轉錄酶。
致癌RNA病毒是一大類能引起鳥類、哺乳類等動物白血病、肉瘤以及其它腫瘤的病毒。這類病毒侵染細胞后并不引起細胞死亡，卻可以使細胞發(fā)生惡性轉化。經(jīng)過改造后可以作為基因治療的載體。
放線菌素D（抑制以DNA為模板的反應，復制和轉錄)能抑制致癌RNA病毒的復制，可見致癌RNA病毒的復制過程必然涉及DNA。
Bader 用嘌呤霉素（puromycin)來抑制靜止細胞蛋白質的合成，發(fā)現(xiàn)這種細胞仍能感染勞氏肉瘤病毒（RSV)，證實反轉錄酶是由反轉錄病毒帶入細胞的，而不是感染后在宿主細胞中新合成的。
一、 反轉錄酶
由一個α亞基和一個β亞基組成，含有Zn2+，具有三種酶活力。
（1)RNA指導的DNA聚合酶活力（以RNA為模板，合成一條互補的DNA，形成RNA—DNA雜種分子)。
（2)RNase H酶活力，水解RNA—DNA雜種分子中的RNA，可沿3’→5’和5’→3’兩個方向起外切酶作用。
（3)DNA指導的DNA聚合酶活力。
模板：RNA或DNA
以自身病毒類型的RNA為模板時，該酶的反轉錄活力最大，但是帶有適當引物的任何種類的RNA都能作為合成DNA的模板。
引物：RNA或DNA
底物：dNTP
二價陽離子：Mg2+或Mn2+
真核mRNA3’端有polyA，加入oligo dT后，可以作為反轉錄酶的模板，合成cDNA。
二、 病毒RNA的反轉錄過程
所有已知的致癌RNA病毒都含有反轉錄酶，因此被稱為反轉錄病毒（retrovirus)，反轉錄病毒的復制需要經(jīng)過一個DNA中間體（前病毒)。
1、 反轉錄病毒的基因組結構
P353 圖19-27
（1) 反轉錄病毒基因組通常由兩條相同的（+)RNA鏈組成。5’端附近區(qū)域以氫鍵結合在一起，全長7-10Kb。
（2) 每一條RNA鏈的兩端具有相同的序列，形成正向重復序列。
（3) 5’端有帽子結構，3’端有polyA，與真核mRNA相似。
（4) 5’端帶有1分子的宿主tRNA，作為反轉錄時的引物。某些鳥類反轉錄病毒攜帶的是tRNAtrp，鼠類是tRNApro
2、 反轉錄過程。
當致癌RNA病毒侵染宿主細胞時，病毒RNA及反轉錄酶一起進入宿主細胞，病毒自身帶入的反轉錄酶使RNA反轉錄成雙鏈DNA。
（1) 以病毒（+)RNA為模板，合成互補的（-)DNA。
（2) 切除RNA—DNA雜種分子中的RNA。
（3) 以（-)DNA鏈為模板，合成（+)DNA鏈，最后形成兩端帶有LTR（長末端重復序列)的雙鏈DNA。
反轉錄病毒只有整合到宿主染色體DNA后才能被轉錄，轉錄產(chǎn)物經(jīng)拼接可以產(chǎn)生不同的病毒mRNA。LTR（長末端重復序列)對前病毒DNA整合到宿主染色體DNA以及整合后的轉錄均起著重要作用。
反轉錄病毒合成的過程：
圖
缺口的模板（基因組)RNA，在U3旁生成一個正鏈DNA的合成RNA的引物，而其余的模板RNA被降解。
正鏈DNA合成開始，復制。
圖
3、 反轉錄病毒的生活周期
P354 圖19-29
（1) 病毒粒子侵染細胞，病毒RNA和反轉錄酶一起進入細胞。
（2) RNA被反轉錄成雙鏈DNA（前病毒)，環(huán)化，進入細胞核。
（3) 反轉錄病毒的DNA整合到宿主染色體DNA中。
（4) 前病毒DNA進行復制，轉錄出功能基因、基因組RNA和病毒蛋白。
（5) 基因組RNA和病毒蛋白在胞質中組裝成新病毒粒子，轉移到質膜，通過出芽方式釋放新病毒粒子。
三、 反轉錄的生物學意義。
1．反轉錄酶存在于所有致癌RNA病毒中，它的存在與RNA病毒引起細胞惡性轉化有關。
2．艾滋病毒（AIDS)
人類免疫缺陷病毒（HIV)，也是一種反轉錄病毒，主要感染T4淋巴細胞和B淋巴細胞。病毒粒子直徑100nm，球狀，粒子外包被兩層脂質質膜，膜上有糖蛋白（gp120、gp41)，另有兩層衣殼蛋白p24、p18。
HIV基因組由兩條單鏈正鏈RNA組成，每個鏈長9.7kb，RNA 5，端有帽子結構，3’端有PolyA，鏈上結合有反轉錄酶。
3．乙肝病毒
大蛋白、中蛋白、主蛋白（表面抗原)
核心抗原
雙鏈環(huán)狀DNA
乙肝病毒與反轉錄病毒的區(qū)別：
P355
4、真核生物正常細胞內(nèi)也存在反轉錄過程
真核生物的談色體基因組中存在為數(shù)眾多的逆假基因和逆基因。
逆假基因：無啟動子和內(nèi)含子，但有polyA的殘基，推測是由mRNA反轉錄后整合到基因組中去的。
逆基因：具有啟動子和轉錄功能，無內(nèi)含子。可能是由于mRNA反轉錄后剛好整合到啟動子的下游處，或者是帶啟動子的RNA序列反轉錄后整合到基因組中
第四節(jié) DNA合成技術
一、 cDNA合成
1、 cDNA文庫的構建
cDNA：以mRNA為模板，用反轉錄酶合成第一鏈，去除mRNA，合成的第二鏈。
cDNA文庫是獲得真核結構基因的最好方法，成熟的mRNA無內(nèi)含子。
（1)、 真核mRNA的分離純化
特點：含量少，不均一，表達具有發(fā)育階段性和組織特異性。
總RNA： rRNA 80~85%
mRNA 1~5%
tRNA及其它小分子RNA 10~15%
不均一：在1~5%的mRNA中，有10000—30000種mRNA。
分離、純化：
用Oligo dT纖維素柱（親和層析法)，加入總RNA，高鹽洗脫，先流出非mRNA，降低鹽濃度，加入Oligo dA競爭，可洗出mRNA 混合物。
免疫法可分離特定的mRNA。
（2)、 cDNA合成（反轉錄酶)
A. 自身引物法（S1核酸酶降解法)
圖
Oligo(dT)15-18個核苷酸
mRNA5’端序列有丟失。
B. 取代合成法（較常用)
圖
Oliyo（dT)與mRNA3’端AAA雜交作為引物，合成第一條DNA鏈。
RNaseH在mRNA上產(chǎn)生多個切口。
DNA pol.Ⅰ切口平移，DNA ligase連接，合成出第二條DNA鏈。
T4DNA pol.切去端頭的RNA-DNA雜交鏈。
C. 引物合成法
可以合成全長cDNA，mRNA的5’端不丟失。
圖
（3)、 cDNA與載體連接
（4)、 重組體的轉化
（5)、 擴增、保存
2、 獲取特定mRNA的cDNA
（1)免疫法分離特定的mRNA
（2)PCR法
二、 PCR技術（聚合酶鏈式反應)
Polymerase chain Reaction
以目的基因或DNA片段為模板，在引物介導及Taq DNA聚合酶催化下，在體外用核苷酸大量合成目的基因或DNA片段。
它能快速、專一地擴增所希望得到的目的基因或DNA片段。
1、 反應物
（1)模板
單、雙鏈DNA或cDNA都可以作為PCR的模板，若以RNA為起始材料，則須經(jīng)反轉錄，獲得第一條cDNA后才能用于PCR。
（2)Taq DNA聚合酶
DNA聚合酶是進行PCR擴增的關鍵，從水生棲熱菌（Thermus aquaticns VT-1)分離出來。
Taq DNA聚合酶有很好的熱穩(wěn)定性，92.5℃處理130min，仍保留50%的酶活性，在74℃活性最高，錯誤摻入核苷酸的比率為1/7500。
（3)引物
引物是決定PCR結果的關鍵，它由寡核苷酸組成，15-30個b
（4)核苷酸dNTP
dNTP的濃度50-200umul/L。
（5)鎂離子Mg2+
2、 PCR原理
圖
變性 95℃
復性 55℃
延伸 72℃
第十四章 RNA的生物合成
RNA的生物合成包括轉錄和RNA的復制。
轉錄（transcription)：以一段DNA的遺傳信息為模板，在RNA聚合酶作用下，合成出對應的RNA的過程，或在DNA指導下合成RNA。
轉錄產(chǎn)物：mRNA 、rRNA、 tRNA、小RNA
除某些病毒基因組RNA外，絕大多數(shù)RNA分子都來自DNA轉錄的產(chǎn)物。
轉錄研究的主要問題
①RNA聚合酶 ②轉錄過程 ③轉錄后加工 ④轉錄的調(diào)控
①~③是基本內(nèi)容，④是目前研究的焦點，轉錄調(diào)控是基因調(diào)控的核心。
轉錄與DNA復制的異同：
相同：要有模板，新鏈延伸方向5’→3’，堿基的加入嚴格遵循堿基配對原則。
相異：①復制需要引物，轉錄不需引物。
②轉錄時，模板DNA的信息全保留，復制時模板信息是半保留。
③轉錄時，RNA聚合酶只有5’→3’聚合作用，無5’→3’及3’→5’外切活性。
轉錄是基因表達的第一步，也是最關鍵的一步。
基因表達的終產(chǎn)物：①RNA ②蛋白質
轉錄過程涉及兩個方面
①RNA合成的酶學過程
②RNA合成的起始信號和終止信號，即DNA分子上的特定序列。
DNA正鏈：與mRNA序列相同的DNA鏈。
負鏈：與正鏈互補的DNA鏈。
轉錄單位的起點核苷酸為+1，起點右邊為下游（轉錄區(qū))，轉錄起點左側為上游，用負數(shù)表示：-1，-2，-3。
第一節(jié) DNA指導的RNA合成（轉錄)
RNA鏈的轉錄，起始于DNA模板的一個特定位點，并在另一位點終止，此轉錄區(qū)域稱為一個轉錄單位。一個轉錄單位可以是一個基因（真核)，也可以是多個基因（原核)。
基因的轉錄是有選擇性的，細胞不同生長發(fā)育階段和細胞環(huán)境條件的改變，將轉錄不同的基因。
轉錄的起始由DNA上的啟動子區(qū)控制，轉錄的終止由DNA上的終止子控制，轉錄是通過DNA指導的RNA聚合酶來實現(xiàn)的。
一、 RNA聚合酶
RNA合成的基本特征
①底物：NTP（ATP、GTP、CTP、UTP)
②RNA鏈生長方向：5’→3’
③不需引物
④需DNA模板
反應：
1、 E.coli RNA聚合酶（原核)
E.coli和其它原核細胞一樣，只有一種RNA聚合酶，合成各種RNA（mRNA、tRNA、rRNA)。
一個E.coli細胞中約有7000個RNA聚合酶分子，在任一時刻，大部分聚合酶（5000左右)正在參與RNA的合成，具體數(shù)量依生長條件而定。
E.coli RNA聚合酶全酶|（holoenzyme)分子量46萬Da，由六個亞基組成，α2ββ’ σω，另有兩個Zn2+。
無σ亞基的酶叫核心酶，核心酶只能使已開始合成的RNA鏈延長，而不具備起始合成活性，加入σ亞基后，全酶才具有起始合成RNA的能力，因此，σ亞基稱為起始因子。
E.coli RNA聚合酶各亞基的大小與功能：
亞基 亞基數(shù) 分子量（KD) 基因 功能 gydjdsj.org.cn
β’ 1 160 rpoC 與模板DNA結合
β 1 150 rpoB 與核苷酸結合，起始和催化部位。
σ 1 70 rpoD 起始識別因子
α 2 37 rpoA 與DNA上啟動子結合
ω 1 9 ---- 不詳
不同的細菌，β’、β、α亞基分子量變化不大，σ亞基分子量變化較大，44KD~92KD。
σ亞基的功能：核心酶在DNA上滑動，σ亞基能增加酶與DNA啟動子的結合常數(shù)，增加停留時間，使聚合酶迅速找到啟動子并與之結合，σ亞基本身無催化活性。
不同的σ因子識別不同的啟動子，從而表達不同的基因。
不同的原核生物，都具有相同的核心酶，但σ亞基有所差別，這決定了原核基因表達的選擇性。
RNA聚合酶的催化活性：RNA聚合酶以完整的雙鏈DNA為模板，轉錄時DNA的雙鏈結構部分解開，轉錄后DNA仍然保持雙鏈的結構。
