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第二法
精密稱取供試品適量(相當(dāng)于維生素D總量600單位以上，重量不超過2.0g)，置皂化瓶中，加乙醇30ml、抗壞血酸0.2g與50％(g／g)氫氧化鉀溶液3ml[若供試量為3g，則加50％(g／g)氫氧化鉀溶液4ml]，置水浴上加熱回流30分鐘，冷卻后，自冷凝管頂端加水10ml沖洗冷凝管內(nèi)壁，將皂化液移至分液漏斗中，皂化瓶用水60～100ml分?jǐn)?shù)次洗滌,洗液并入分液漏斗中，用不含過氧化物的乙醚振搖提取3次，第一次60ml,以后每次 40ml，合并乙醚液，用水洗滌數(shù)次，每次約100ml，洗滌時(shí)應(yīng)緩緩旋動(dòng)，避免乳化,直至水層遇酚酞指示液不再顯紅色，靜置，分取乙醚提取液，加入干燥濾紙條少許振搖除去乙醚提取液中殘留的水分，分液漏斗及濾紙條再用少量乙醚洗滌，洗液與提取液合并，置具塞圓底燒瓶中，在水浴上低溫蒸發(fā)至約5ml，再用氮?dú)饬鞔蹈�，迅速精密加入甲�?ml，密塞，超聲處理助溶后，移入離心管中，離心，取上清液作為供試品溶液A。
凈化用色譜柱系統(tǒng)分離收集維生素D
精密量取上述供試品溶液A 500μl,注入以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的液相色譜柱，以甲醇－乙腈－水(50∶50∶2) 為流動(dòng)相進(jìn)行分離，檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm，從計(jì)錄儀上觀察色譜圖，要求維生素D與前維生素D為疊峰，并能與維生素A及其他干擾含量測(cè)定的雜質(zhì)分開；準(zhǔn)確收集含有維生素D及前維生素D混合物的全部流出液，置具塞圓底燒瓶中，用氮?dú)饬餮杆俅蹈?精密加入已知內(nèi)標(biāo)濃度的正己烷溶液適量(不少于2ml，并使每1ml中含維生素D為50～140單位,內(nèi)標(biāo)物質(zhì)與維生素D的重量比約為4∶1)，密塞，超聲處理助溶，即為供試品溶液B。 醫(yī).學(xué).全.在.線gydjdsj.org.cn
取供試品溶液B，按第一法進(jìn)行含量測(cè)定，進(jìn)樣量為100～200μl。
第三法
供試品溶液的制備
取各該制劑項(xiàng)下制備的供試品溶液A,按上述第二法凈化用色譜柱系統(tǒng)分離維生素D項(xiàng)下的方法處理,至“用氮?dú)饬餮杆俅蹈伞焙? 加入異辛烷2ml溶解,通氮排除空氣后，密塞，置90℃水浴中，加熱1.5小時(shí)后，立即通氮在2分鐘內(nèi)吹干，迅速精密加入正己烷2ml，溶解后，即為供試品溶液C。
對(duì)照品溶液的制備
精密量取對(duì)照品貯備溶液適量,加異辛烷定量稀釋制成每1ml中約含維生素D 50單位，精密量取2ml置具塞圓底燒瓶中，照供試品溶液制備項(xiàng)下的方法,自“通氮排除空氣后”起，依法操作，得對(duì)照品溶液。
含量測(cè)定
在上述第一法的色譜條件下，取對(duì)照品溶液與供試品溶液C,交替精密進(jìn)樣200μl，量取維生素D的峰值，按外標(biāo)法計(jì)算含量。
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