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本法系用高效液相色譜法(附錄Ⅴ Ｄ)測(cè)定維生素D(包括維生素D<[2]>和D<[3]>,下同)及其制劑、維生素AD制劑或魚(yú)肝油中所含維生素D及前維生素D經(jīng)折算成維生素D的總量，以單位表示，每單位相當(dāng)于維生素D0.025μg。
測(cè)定應(yīng)在半暗室中及避免氧化的情況下進(jìn)行。
無(wú)維生素A醇及其他雜質(zhì)干擾的供試品可用第一法測(cè)定，否則應(yīng)按第二法處理后測(cè) 定；如果按第二法處理后，前維生素D峰仍受雜質(zhì)干擾，僅有維生素D峰可以分離時(shí)，則應(yīng)按第三法測(cè)定。
第一法
對(duì)照品貯備溶液的制備
根據(jù)各制劑中所含維生素D的成分,精密稱取相應(yīng)的維生素D<[2]>或D<[3]>對(duì)照品25mg,置100ml棕色量瓶中，加異辛烷80ml，避免加熱，用超聲處理助溶1分鐘使完全溶解，加異辛烷至刻度，搖勻，充氮密塞，避光，0℃以下保存。
測(cè)定維生素D<[2]>時(shí)，應(yīng)另取維生素D<[3]>對(duì)照品25mg，同法制成維生素D<[3]>對(duì)照品貯備溶液，供系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用。
內(nèi)標(biāo)溶液的制備
稱取鄰苯二甲酸二甲酯25mg，置25ml量瓶中，加正己烷至刻度，搖勻。
色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)
用硅膠為填充劑，正己烷－正戊醇（997∶3）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm。量取維生素D<[3]>對(duì)照品貯備溶液5ml，置具塞玻璃容器中，通氮后密塞，置90℃水浴中加熱1小時(shí)，取出迅速冷卻，加正己烷5ml，搖勻，置1cm具塞石英吸收池中，在2支8W主波長(zhǎng)分別為254和365nm的紫外光燈下，將石英吸收池斜放成45°,并距燈管5～6cm,照射5分鐘,使溶液中含有前維生素D<[3]>、反式維生素D<[3]>、維生素D<[3]>和速甾醇D<[3]>；取此溶液注入液相色譜儀，測(cè)定維生素D<[3]>的峰值，先后進(jìn)樣5次,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0％；前維生素D<[3]>(與維生素D<[3]>的比保留時(shí)間約為0.5)與反式維生素D<[3] >(與維生素D<[3]>的比保留時(shí)間約為 0.6)以及維生素D<[3]>與速甾醇D<[3]>(與維生素D<[3]>的比保留時(shí)間約為1.1)的峰分離度均應(yīng)大于1.0。
校正因子測(cè)定 醫(yī)學(xué).全在.線www.med126.com
精密量取對(duì)照品貯備溶液和內(nèi)標(biāo)溶液各5ml,置50ml量瓶中，加正己烷至刻度，搖勻；取一定量注入液相色譜儀，計(jì)算維生素D的校正因子f<[1]>。
另精密量取對(duì)照品貯備溶液5ml置50ml量瓶中，加入2,6－二叔丁基對(duì)甲酚結(jié)晶1粒,通氮排除空氣后，密塞，置90℃水浴中加熱1．5小時(shí)，取出迅速冷卻至室溫，精密加內(nèi)標(biāo)溶液5ml，加正己烷至刻度，搖勻；取一定量注入液相色譜儀，計(jì)算前維生素D折算成維生素D的校正因子f<[2] >。
f<[2]>＝(A<[s]>·m<[r]>－f<[1]>m<[s]>A<[r1]>)／A<[r2]>·m<[s]>
式中
A<[s]>為內(nèi)標(biāo)的峰值；
m<[r]>為加入對(duì)照品的量；
f<[1]>為維生素D的校正因子；
m<[s]>為加入內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的量；
A<[r1]>為維生素D的峰值；
A<[r2]>為前維生素D的峰值。
含量測(cè)定
取各該制劑項(xiàng)下制備的供試品溶液進(jìn)行測(cè)定,按下列公式計(jì)算維生素D及前維生素D折算成維生素D的總量。
mi＝(f<[1]>·A<[i1]>＋f<[2]>A<[i2]>)·m<[s]>／A<[s]>
式中
A<[i1]>為維生素D的峰值；
A<[i2]>為前維生素D的峰值；
m<[s]>為加入內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的量；
A<[s]>為內(nèi)標(biāo)的峰值。
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