細(xì)胞因子在機(jī)體免疫應(yīng)答過程中起著十分重要的作用。在某些疾病時，體內(nèi)細(xì)胞因子及其受體表達(dá)可發(fā)生異常，與機(jī)體免疫功能低下或發(fā)生病理損傷有關(guān)。因此，在臨床免疫學(xué)中越來越重視對細(xì)胞因子及其受體的檢測。在基礎(chǔ)免疫研究中，常需檢測不同條件培養(yǎng)液中細(xì)胞因子的活性，并探討細(xì)胞因子產(chǎn)生水平與免疫細(xì)胞表型、增殖、殺傷及其它功能的關(guān)系。此外，原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中表達(dá)的重組細(xì)胞因子或經(jīng)過不同工藝純化后的產(chǎn)品需測定其活性和含量。
從細(xì)胞因子及其受體檢測的水平來說，可以分為基因組DNA、mRNA和蛋白三個不同的水平，后者又包括胞漿內(nèi)、膜表面以及分泌到體液或培養(yǎng)上清等三種不同形式細(xì)胞因子。目前應(yīng)用最多的是檢測體液或培養(yǎng)豐清中的細(xì)胞因子以及膜表面的細(xì)胞因子受體。
細(xì)胞因子生物學(xué)活性檢測法是根據(jù)某些細(xì)胞因子特定的生物學(xué)活性，應(yīng)用相應(yīng)的指示系統(tǒng)和標(biāo)準(zhǔn)品來反映待測標(biāo)本中某種細(xì)胞因子的活性水平，一般以活性單位來表示。生物學(xué)檢測法一般敏感性較高，直接表示待測標(biāo)本中的活性水平。但實驗周期較長，如集落形成法需10～14；易受細(xì)胞培養(yǎng)中某些因素的影響，如血清、pH、藥物；易受生物學(xué)活性相同或相近的其它細(xì)胞因子的影響，如檢測IL-2時可受IL-4的干擾，TNF-α和TNF-β（淋巴毒素)表現(xiàn)出極為相似的生物學(xué)作用；易受待栓樣品中某些細(xì)胞因子抑制物的干擾，如IL-1活性可被IL-1受體拮抗物（IL-1ra)所抑制，TNF-α可被TNF-BP所阻斷；不能區(qū)分某些細(xì)胞因子的型和亞型，如IFN-α、β和γ，以及IFN-α中不同的亞型顯示相同的生物學(xué)活性；某些指示細(xì)胞長期培養(yǎng)易發(fā)生突變；不同指示細(xì)胞對同一種細(xì)胞因子的敏感性不同，所慕名而來結(jié)果難于標(biāo)準(zhǔn)化；此外，某些人源的細(xì)胞因子如hIL-2對小鼠細(xì)胞起作用，但鼠源性的IL-2對人的細(xì)胞則無刺激作用。
生物學(xué)檢測的方法大致可分為增殖或增殖抑制、集落形成、直接殺傷靶細(xì)胞、保護(hù)靶細(xì)胞免受病毒攻擊、趨化作用以及抗體形成法等幾類。
（一)增殖或增殖抑制法
其基本gydjdsj.org.cn/rencai/原理是應(yīng)用某一細(xì)胞因子能特異地刺激或抑制某些指示細(xì)胞的增殖，通過3H-TbR摻入或MTT法顯色，反映待檢細(xì)胞因子的活性水平。
（二)集落形成法
其基本原理是應(yīng)用骨髓干細(xì)胞體外半固體培養(yǎng)系統(tǒng)，根據(jù)不同造血因子能誘導(dǎo)干細(xì)胞或定向造血祖細(xì)胞形成某一種或某些種類細(xì)胞的集落，通過對形成集落形態(tài)學(xué)、酶學(xué)鑒定，計算不同種類集落形成的數(shù)量和比例，反映待測標(biāo)本中CSF的種類和活性水平。
（三)直接殺傷靶細(xì)胞
在細(xì)胞因子中TNF-α、TNF-β具有直接殺傷某些腫瘤細(xì)胞的作用，采用TNF敏感的細(xì)胞株如小鼠成纖維細(xì)胞株L929，以及WEHI164亞克隆13作為指示細(xì)胞，通過3H-TdR釋放法或染料染色等可檢測待檢樣品中TNF的活性水平。
（四)保護(hù)靶細(xì)胞免受病毒的攻擊
靶細(xì)胞受某些病毒感染后可發(fā)生明顯病變和死亡，干擾素可保護(hù)靶細(xì)胞免受病毒的攻擊，常用的病毒是水皰性口炎病毒（vesicular stomatitis virus,VSV),敏感的指示細(xì)胞為喉癌的上皮細(xì)胞株Hep2和羊膜的上皮細(xì)胞WISH，通過干擾素（IFN-α、IFN-β、IFN-γ)抑制病毒致病變的程度，計算出待測樣品中IFN的活性單位。
（五)趨化作用
IL-8對多形核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞具有趨化作用，可用小室法或軟瓊脂趨化法，PMN或淋巴細(xì)胞作為指示細(xì)胞，以細(xì)胞趨化的程度來反映樣品中IL-8活性水平。
（六)抗體形成法
IL-6可在體外刺激某些B淋巴細(xì)胞系產(chǎn)生和分泌免疫球蛋白，常用的指示細(xì)胞有分泌IgG的ARH-77、CESS和分泌IgM的SKW6.CL-4。在一定的條件下，待檢樣品中IL-6水平與培養(yǎng)細(xì)胞上清IgG或IgM水平正相關(guān)，通過標(biāo)準(zhǔn)IL-6的對照可推算出待檢樣品中IL-6的活性。
表4-22 細(xì)胞因子生物學(xué)活性檢測方法（舉例)
| 被檢細(xì)胞因子 | 實驗系統(tǒng) | 可干擾的gydjdsj.org.cn/Article/因素 | |
| IL-1 | D.10（小鼠T細(xì)胞) | 增殖法（3H-TdR、MTT) | 人IL-2；小鼠IL-2、IL-4、IL-7、GM-CSF、TNF等 |
| 小鼠胸腺細(xì)胞 | 增殖法 | TGF-β1、β2抑制作用 | |
| IL-4（小鼠胸腺瘤) | CTLL轉(zhuǎn)換法（增殖法) | 小鼠IL-4 | |
| 黑素瘤細(xì)胞A352 | 增殖抑制法 | ||
| IL-2 | CTLL（小鼠殺傷性T細(xì)胞系) | 增殖法 | 小鼠IL-4 |
| IL-3 | KG1（髓樣白血病細(xì)胞) | 增殖法 | |
| TF-1（前髓樣細(xì)胞) | 增殖法 | EPO、IL-5、IL-6、GM-CSF | |
| 小鼠造血細(xì)胞系FDCP-1 | 增殖法 | GM-CSF | |
| 人巨核母細(xì)胞白血病細(xì)胞系Mo7E | 增殖法 | GM-CSF、IL-9 | |
| 骨髓半固體造血祖細(xì)胞集落形成 | 20α類固醇脫氫酶 | GM-CSF | |
| 集落種類和數(shù)量 | GM-CSF、IL-1、IL-6、G-CSF、M-CSF | ||
| IL-4 | 小鼠B細(xì)胞 | 誘導(dǎo)CD23、MHCⅡ類 | IFN-γ有抑制作用 |
| 抗原表達(dá) | |||
| PHA刺激的小鼠T細(xì)胞 | 增殖法 | IL-2 | |
| IL-4依賴細(xì)胞株 | 增殖法 | IL-2 | |
| 人IL-4R轉(zhuǎn)染CTLL | 增殖法 | IL-2 |
續(xù)表1
| 被檢細(xì)胞因子 | 實驗系統(tǒng) | 可干擾的因素 | |
| IL-5 | 抗Ig（或SAC)刺激B細(xì)胞誘導(dǎo)人或小鼠骨髓半固體培養(yǎng)中嗜酸性粒細(xì)胞成熟 | 增殖法 | IL-3 |
| 抗Ig處理的小鼠B細(xì)胞 | IgM分泌 | ||
| BCL-1（B淋巴瘤細(xì)胞) | 增殖法 | IL-4 | |
| IL-6 | TF-1（前髓樣細(xì)胞) | 增殖法 | EPO、IL-3、IL-5、GM-CSF |
| B9（小鼠雜交瘤細(xì)胞) | 增殖法 | 小鼠IL-4、IL-11 | |
| 7TD1（小鼠雜交瘤細(xì)胞) | 增殖法 | IL-11 | |
| BM60 | 增殖法 | ||
| HepG2（肝細(xì)胞) | Fibronogen產(chǎn)生 | LIF | |
| CESS（EBV轉(zhuǎn)化人B細(xì)胞) | IgGβ1、TGF-β2有抑制作用 | ||
| DKW6.CL-4 | IgM產(chǎn)生 | TGFβ1、TGF-β2有抑制作用 | |
| IL-7 | 骨髓前B細(xì)胞 | 增殖法 | |
| IL-8 | 中性粒細(xì)胞 | 軟瓊脂趨化法 | 其它化學(xué)趨化物質(zhì) |
| 小室趨化法 | G-CSF、M-CSF | ||
| IL-9 | Mo7E（巨核細(xì)胞白血病系) | 增殖法 | IL-3、GM-CSF |
| IL-11 | 7TD1（小鼠雜交瘤細(xì)胞系) | 增殖法 | IL-6 |
| B9（小鼠雜交瘤細(xì)胞系) | 增殖法 | 小鼠IL-4、IL-6 | |
| T1165 | 增殖法 | IL-6 | |
| IL-12 | PBMC | IFN-γ產(chǎn)生 | IFNα/β/γ |
| PHA活化T淋巴母細(xì)胞 | 增殖法 | IL-2、IL-4 | |
| PBL | LAK殺傷（與IL-2協(xié)同) | IL-2、IL-6 | |
| 骨髓祖細(xì)胞 | GM集落形成 | IL-3；TGF-β有抑制作用 | |
| TF-1（前髓樣細(xì)胞) | 增殖法 | EPO、IL-3、IL-5、IL-6 | |
| 小鼠造血細(xì)胞FDCP-1 | 增殖法 | IL-3 | |
| 人巨核母細(xì)胞白血病細(xì)胞系Mo7E | 增殖法 | IL-3、IL-9 | |
| AML-193 | 增殖法 | ||
| 造血祖細(xì)胞 | 粒細(xì)胞集落形成 | IL-3、IL-9 | |
| 中性粒細(xì)胞 | 活化后超氧釋放 | GM-CSF | |
| WEHI164亞克隆13或L929 | 殺傷作用 | GM-CSF、IL-6 | |
| TNF-α和TNF-β（LT)有相似的殺傷作用 |
續(xù)表2
| 被檢細(xì)胞因子 | 實驗系統(tǒng) | 可干擾的因素 | |
| PDGF | 成纖維細(xì)胞和SS、WHG、WI26、WI28 | 增殖法 | FGF（1、2、5)、EGF、TGF-β、IL-1、TNF等 |
| INF-α/β/γ | 上皮細(xì)胞如Hep-2、Wish | 抵抗病毒（如VSV)的致病變作用 | FN-α/β/γ有相似的生物學(xué)活性 |
| TGF-β | 成纖維細(xì)胞（半固體培養(yǎng)) | 增殖法 | |
| 成骨細(xì)胞單層培養(yǎng) | 增殖法 | ||
| PHA刺激PBMC | 增殖抑制法 | ||
| ConA/IL-1誘導(dǎo)胸腺細(xì)胞 | 增殖抑制法 | IL-2、IL-4 | |
| 人黑素瘤細(xì)胞A375 | 增殖抵制法 | IL-1、IL-2、IL-4 |
免疫學(xué)檢測法的基本原理是細(xì)胞因子（或受體)與相應(yīng)的特異性抗體（單克隆抗體或多克隆抗體)結(jié)合，通過同位素、熒光或酶等標(biāo)記技術(shù)加以放大和顯示，從而定性或定量顯示細(xì)胞因子（或受體)的水平。這類方法的優(yōu)點是實驗周期短，少受抑制物或相似生物池功能因子的干擾，如抗體的特異性高可區(qū)分不同型或亞型的細(xì)胞因子（如IFN)，一次能檢測大量標(biāo)本，易標(biāo)準(zhǔn)化。與生物學(xué)活性檢測方法相比，免疫學(xué)檢測法在許多情況下敏感性低于前者，所得結(jié)果不表示生物學(xué)活性，有的McAb只能識別重組的細(xì)胞因子，在檢測天然的細(xì)胞因子中受到限制。
免疫學(xué)檢測的方法多采用ELISA和RIA法，可以分為平心法、競爭法和間接法。
根據(jù)抗體性質(zhì)和特異性不同可有以下幾種不同的平心法ILISA。
1.PcAb與McAb夾心法 用純化的多克隆抗體（PcAb)包被板子，加待檢細(xì)胞因子（或可溶性受體)和標(biāo)準(zhǔn)品，上層加酶標(biāo)記的McAb。有時為了增加敏感性，上層加McAb后再用酶標(biāo)記第二抗體顯色。
2.McAb與PcAb夾心法 用McAb包被板子，加待檢樣品，上層加酶標(biāo)記的PcAb。有時為了增加敏感性，上層加PcAb后再用釗對PcAb的酶標(biāo)記抗抗體。
3.雙McAb夾心法 選擇和應(yīng)用識別同一個細(xì)胞因子（或受體)分子上不同表位的兩種McAb，其中一種包被板子，另一種McAb標(biāo)記酶。由于單克隆抗體親和力識別表位地勻一，從質(zhì)量控制角度來看，一般比上兩種夾心法易控制。如目前已商品化檢測細(xì)胞因子（或其受體)的檢測盒大多采用雙單克隆抗體夾心法。
4.細(xì)胞、McAb夾心法 用表達(dá)IL-2R的MT-1細(xì)胞包被板子，加入待檢IL-2或標(biāo)準(zhǔn)品，上層加125I標(biāo)記的McAb，根據(jù)γ計數(shù)cpm值推算出待檢IL-2含量。
有報道用況爭法檢測IL-2水平。用免抗IL-2PcAb包袱板子，同時加入125I標(biāo)記的IL-2和待測IL-2，根據(jù)γ計數(shù)cpm值得知待檢IL-2對125I-IL-2與PcAb競爭結(jié)合的程度，從而推算出待測標(biāo)本IL-2的含量。這種方法檢測IL-2的敏感性可達(dá)50pg/ml。
為了增加敏感性，在上述系統(tǒng)中可再連接上生物素，再用鏈霉親和素（streptavidin)酶標(biāo)記物進(jìn)行放大。此外，還可用化學(xué)發(fā)光、改進(jìn)顯色底物等措施提高檢測方法的敏感性。
表4-23 細(xì)胞因子生物學(xué)活性與免疫學(xué)檢測方法的比較
| 生物學(xué)活性法 | 免疫學(xué)檢測法 | |
| 原理 | 細(xì)胞因子特定的 | 細(xì)胞因子與相應(yīng)抗體 |
| 生物學(xué)活性 | 特異性結(jié)合反應(yīng) | |
| 結(jié)果表示 | 生物學(xué)活性水平 | 含 量 |
| 敏感性 | 一般較高 | 一般較低 |
| （與細(xì)胞表面高親和力受體有關(guān)) | （加放大系統(tǒng)可明顯升高) | |
| 特異性 | 低 | 高 |
| （識別類型、亞型) | （不能) | （不可能) |
| 周 期 | 較 長 | 短 |
| 受實驗條件影響 | ||
| 培養(yǎng)條件 | 大 | 小 |
| 指示細(xì)胞敏感性差異 | 大 | ／ |
| 指示細(xì)胞突變 | 可發(fā)生 | ／ |
| 生物學(xué)作用相同因子干擾 | 大 | 小 |
| 樣品中特異性或非特異性 | 大 | 小 |
| 抑制物干擾 | ||
| 重復(fù)性 | 較 差 | 較 好 |
| 標(biāo)準(zhǔn)化、大量檢測 | 困 難 | 容 易 |
許多細(xì)胞因子產(chǎn)生過程中，有一個胞漿到胞膜，再釋放到體液或培養(yǎng)上清中的動態(tài)變化。一般可采用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)或免疫熒光技術(shù)檢測細(xì)胞或組織切片中細(xì)胞因子（或受體)定位（胞漿、胞膜)，產(chǎn)生細(xì)胞的頻數(shù)，以及胞漿、胞膜、上清中濃度改變的動態(tài)變化。目前已報道IL-2、TNF-α、IFN-γ等細(xì)胞因子以及幾科所有細(xì)胞因子的受體可用這類方法進(jìn)行檢測。流式細(xì)胞儀（FCM)與間接免疫熒光法相結(jié)合檢測細(xì)胞膜表面細(xì)胞因子受體，可獲得客觀正確的結(jié)果。用同位素標(biāo)記配體或標(biāo)記抗細(xì)胞因子受體的抗體，進(jìn)行競爭結(jié)合試驗，可檢測細(xì)胞因子受體表達(dá)的數(shù)量以及親和力大小。
通過核酸標(biāo)記技術(shù)可將細(xì)胞因子cDNA作為基因探釗檢測細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子基因組DNA或mRNA。主要有以下幾種方法：
1.應(yīng)用同位素（或非同位素)標(biāo)記的cDNA探針，檢測經(jīng)Northernblot后細(xì)胞因子mRNA水平或采用打點雜交法。
2.應(yīng)用標(biāo)記cDNA探釗與細(xì)胞或組織切片進(jìn)行原位雜交，然后進(jìn)行放射自顯影。
3.細(xì)胞因子mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用特異性細(xì)胞因子引物經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)擴(kuò)增細(xì)胞因子cDNA,Southern blot后用標(biāo)記探針檢測特異細(xì)胞因子DNA水平。
（金伯泉)
