細胞和分子免疫學:第八節(jié)　淋巴細胞信號轉導研究中常用方法

信號轉導是目前分子免疫學中研究的熱點。免疫學中所涉及的信號轉導主要包括淋巴細胞的信號轉導以及細胞因子/細胞因子受體的信號轉導，其研究手段多種多樣，包括細胞生物學、分子生物學以及蛋白質化學等技術。本節(jié)將扼要介紹目前信號轉導研究中常用的方法和技術。

一、磷酸化的信號轉導分子的鑒定

在淋巴細胞信號轉地過程中可發(fā)生多種蛋白底物的磷酸化，包括酪氨酸磷酸化、蘇氨酸殘基磷酸化及絲氨酸殘基磷酸www.med126.com化。它們分別由不同的蛋白激酶所催化。這些磷酸化蛋白通常都為信號轉導分子，在信號傳遞過程中發(fā)揮重要的作用。一些信號蛋白結構中含SH-2結構域可同某些磷酸化的酪氨酸殘基相結合，使信號得以逐級傳遞。含酪氨酸磷酸化的蛋白鑒定通常是首先分離粗提蛋白，采用針對含這些氨基酸殘基磷酸化蛋白的單克隆抗體進行免疫沉淀�。╥mmunoprecipitation)，SDS-PAGE電泳，然而采用Western blotting及immunoblotting鑒定其分子量，進一步利用分子生物學技術克隆信號蛋白，搞清其基因結構和氨基酸序列。

二、信號轉導中第二信使含量的測定

信號轉導過程中，第二信使（second messenger)含量的高低同信號傳遞密切相關。目前測定的第二信使主要包括細胞內Ca²⁺（[Ca²⁺]i)、二�；�甘油（DAG)、三磷酸肌醇（IP3)以及環(huán)腺苷酸（cAMP)等。

1.[Ca²⁺]i的測定　細胞內Ca²⁺的測定方法有原子吸收光譜法、離子微電極測定法、放射示蹤法及標記示蹤法等。目前常用標記示蹤法，即用熒光探針標記靶細胞。常用的熒光探針有quin-2/Am、Fura-2/Am及Indo-1等。Fura-2/Am和Indo-1較為敏感。

2.IP3的測定　采用³H-TdR標記的肌醇標記靶細胞后，用不同的刺激劑刺激細胞，分離磷脂酰肌醇混合物，通過陰離子交換層析柱（Serva公司Dowex1*8)分離洗脫，收集IP3洗脫峰后進行液閃測定。此外，還可以使用Amersham公司生產的D-myo-IP3[³H]分析系統(tǒng)直接測定粗提物中的IP3含量，此方法簡易、敏感。

3.DAG的測定　首先提取含DAG的樣品，然后采用Amersham公司生產的DAG分析系統(tǒng)進行測定。此系統(tǒng)測定的原理是用DAG激酶催化底物DAG，使之發(fā)生磷酸化，外源加入³²γ-ATP，最后將反應產物進行分離后測定放射性含量，根據標準品計算出樣品中DAG的含量。

4.cAMP的測定　可選擇不同的方法：（1)cAMP[³H]分析系統(tǒng)，其優(yōu)點是放射性半衰期長，可用于大量樣品的分析；（2)cAMP[¹²⁵I]分析系統(tǒng)，用于小量樣品的分析；（3)cAMp ILISA測定方法，此方法簡便、敏感。

三、激酶活性的測定

信號轉導過程中往往涉及多種激酶的活化，因而對這些激酶活性的測定可以作為信號轉導研究中的一種重要指標。常見激酶活性的測定有PTK、PKC及PI-3K等。均有商品化的試劑盒。檢測原理是根據激酶可以催化特定底物發(fā)生磷酸化，外源加入³²γ-ATP，通過分離反應產物后測定放射活性，從標準曲線推算出樣品酶的活性。前已提及，PKC從胞質向胞膜的轉位是PKC活化的一個重要指標，因而分離胞質和胞膜中的PKC并分別測定其活性，計算胞膜上PKC活性占總PKC活性的比例，從而判定PKC的活化程度。

四、細胞核轉錄因子的分離和鑒定

信號轉導的結果是細胞核內一些轉錄因子同DNA上某些特定的序列結合，調節(jié)轉錄活性和基因的表達水平。因而分離鑒定細胞內核轉錄因子在信號轉導研究中具有獨特的意義。根據核轉錄因子可與一些特定的核甘酸序列結合的特點，將其特定的核苷序列標記上同位素，來鑒定信號轉導中的核轉錄因子。核轉錄因子具有一些特征性的結構域，即亮氨酸拉鏈（lucine zipper)、鋅指結構（zinc finger)和螺旋-轉角-螺旋（helix-turn-helix)結構。并且受用足跡法（foot printing)分析新發(fā)現(xiàn)核轉錄因子結合DNA的位置和核甘酸序列。

隨著分子生物學核技術的發(fā)展，信號轉導研究取得很大進展。采用基因克隆技術發(fā)現(xiàn)了越來越多的信號蛋白分子；嵌合分子的構建及基因轉染等技術的應用為細胞因子的信號轉導研究提供了有效的手段；點突變、肽競爭等技術使信號蛋白中某些功能區(qū)的作用的研究變得更為精確。

（夏海濱 金伯泉)