實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸:第二節(jié)　放射性碘標(biāo)記

在RIA中，標(biāo)記抗原質(zhì)量的優(yōu)劣，直接影響測定結(jié)果，必須制備比放射性強(qiáng)、純度高的標(biāo)記抗原，并保持免疫活性不受喪失。

一、同位素的選擇

同位素有穩(wěn)定性和放射性兩種。放射性同位素可利用其衰變時(shí)放出的放射線進(jìn)行測量，這種測量較靈敏而方便，故多用放射性同位素。標(biāo)記抗原，常用的放射性同位素有³H、¹⁴C、¹³¹I和¹²⁵I等。在使用上各有其優(yōu)缺點(diǎn)，可根據(jù)所進(jìn)行的放射免疫分析的類型特點(diǎn)，標(biāo)記物制備和供應(yīng)情況以及實(shí)驗(yàn)室設(shè)備條件等作適當(dāng)?shù)倪x擇（表8-1)。大多數(shù)抗原分子中都含有C、H等原子，所以用¹⁴C或³H標(biāo)記不改變抗原的結(jié)構(gòu)及其免疫學(xué)活性，且¹⁴C、³H半衰期長，所標(biāo)記的抗原長時(shí)間放置后仍可使用，這都是其優(yōu)點(diǎn)。¹⁴C或³H標(biāo)記的不足之處是操作較繁瑣，并難以獲得高比放射性的標(biāo)記物；³H及¹⁴C放出的都是弱β射線，需用較昂貴的液體閃爍計(jì)數(shù)器方能獲得較高效率的測量，且測定操作也較麻煩。但某些抗原用放射性碘標(biāo)記容易喪失免疫化學(xué)或生物學(xué)活性者，則仍以采用³H或¹⁴C標(biāo)記物為佳。

表8-1 標(biāo)記抗原常用的放射性同位素及其性質(zhì)

大多數(shù)抗原分子中是不含碘的,引入碘原子就改變了抗原的分子結(jié)構(gòu)，往往容易損傷抗原的免疫化學(xué)活性；且放射性碘的半衰期較短，標(biāo)記物放置后因衰變使放射性降低，因而需要經(jīng)常制備標(biāo)記物或要求能定期提供放射性碘標(biāo)記都能適用，放射性碘放出γ—射線，用一般晶體閃爍計(jì)數(shù)器就能獲得較高效率而精確的測量，測量操作也很簡單。由于這些突出的優(yōu)點(diǎn)，目前在放射免疫分析中，使用放射性碘標(biāo)記物最多。

從應(yīng)用角度來看，¹³¹I和¹²⁵I又各有其優(yōu)缺點(diǎn)，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求、儀器的條件和放射性碘制劑的規(guī)格等條件合理選用。但相對(duì)而言，¹²⁵I有較多的優(yōu)點(diǎn)，一是半衰期適中，允許標(biāo)記化合物的商品化及貯存應(yīng)用一段時(shí)間；二是它只發(fā)射28keV能量的X射線和35keV能量的γ射線，而無β粒子，因而輻射自分解少，標(biāo)記化合物有足夠的穩(wěn)定性。放射性碘適用于放射免疫分析許多對(duì)象（包括蛋白質(zhì)、肽類、固醇類、核酸類以及環(huán)型核苷酸衍生物等)的標(biāo)記，且操作簡單，一般實(shí)驗(yàn)室都不難做到。

二、蛋白質(zhì)與多肽激素的放射性碘標(biāo)記

要制備高比度、高純度與免疫化學(xué)活性好的標(biāo)記物，首先要有高純度、良好免疫活性的抗原。用作放射標(biāo)記加網(wǎng)免疫分析的特異性，所以若用純度不高的抗原作標(biāo)記，則標(biāo)記后必須采取適當(dāng)?shù)牟襟E除去雜質(zhì)，以獲得高純度的標(biāo)記物。標(biāo)記對(duì)象的純化應(yīng)盡量采用溫和的方法，否則在純化操作中已受潛在性損傷的蛋白質(zhì)（這時(shí)表面上活性可能還是良好的)，再經(jīng)標(biāo)記反應(yīng)時(shí)所受的損傷，活性就會(huì)顯著降低，影響以后的放射分析結(jié)果。有了好的純抗原，還要采用適當(dāng)方法加以標(biāo)記，盡量獲取高比放射性、而又能保持良好的特異免疫化學(xué)活性的標(biāo)記物。這些都是放射免疫分析能取得高特異性和高靈敏度的關(guān)鍵問題。

多肽激素與蛋白質(zhì)多用碘標(biāo)記，最常用的是¹²⁵I。碘化反應(yīng)的基本過程如下：通過氧化劑的作用，使碘化物（¹²⁵I^-)氧化成的碘分子（¹²⁵I₂)，再與多肽激素、蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸殘基發(fā)生碘化作用。所以不管采用哪一種放射性碘標(biāo)記法，標(biāo)記的化合物內(nèi)部必須有碘原子可結(jié)合的基團(tuán)，即結(jié)構(gòu)上要含有酪胺基或組織胺殘基。凡蛋白質(zhì)、肽類等抗原，在結(jié)構(gòu)上含有上述基團(tuán)的可直接用放射性碘進(jìn)行標(biāo)記。如不含上述基團(tuán)的，放射性碘無法標(biāo)記，必須在這些化合物的結(jié)構(gòu)上連接上述基團(tuán)后才能進(jìn)行碘標(biāo)記。

因此影響蛋白質(zhì)、多肽碘化效率的因素，主要決定于蛋白質(zhì)、多肽分子中酪氨酸殘基的數(shù)量及它們在分子結(jié)構(gòu)中暴露的程度；此外，碘化物的用量、反應(yīng)條件（pH、溫度、反應(yīng)時(shí)間等)及所用氧化劑的性質(zhì)等也有影響。

常用的標(biāo)記方法有：

（一)氯胺T法

氯胺T法標(biāo)記效率高、重復(fù)性好、試劑便宜易得，是目前使用最多的碘標(biāo)記方法。

1．原理 氯氨—T（Chloramine--T)是一種溫和的氧化劑，在水溶液中產(chǎn)生次氯酸，可使碘陰離子氧化成碘分子。這活性碘可取代肽鏈上酪氨酸苯環(huán)上羥基位的一個(gè)或兩個(gè)氫，使之成為含有放射性碘化酪氨酸的多肽鏈。

2．方法 以¹²⁵I—AVP的制備為例。

（1)碘化反應(yīng)：AVP5μg+0.5mol/lPB50μl（pH7.5)+¹²⁵1800μCi,混合后，加入新配置的Ch—t 30μg/15μl(0.05mol/l PB, pH7.5)。迅速振蕩混勻，室溫下反應(yīng)40s。

（2)終止碘化反應(yīng)：加入還原劑偏重亞硫酸鈉40μg/20μl(0.05mol/l PB, pH7.5),以終止碘化反應(yīng)。

（3)Bio—Gel P₂層析純化：將碘化反應(yīng)混合液注入Bio—Gel P₂柱，用0.1n HAC溶液洗脫，分部收集，每2min收集一管，共收集60管。

（4)放射性測量：測定各收集管的放射性，出現(xiàn)兩個(gè)峰，第一峰為¹²⁵I—AVP，第二峰為游離碘鹽峰。第一個(gè)峰中計(jì)算最高的幾管，留下備用。

為了解標(biāo)記抗原的質(zhì)量，每次碘標(biāo)記后應(yīng)計(jì)算出碘的利用率，標(biāo)記上多少放射性碘，以及每微克抗原結(jié)合上多少放射性碘。

（5)標(biāo)記抗原的貯存：經(jīng)純化與檢查后的標(biāo)記物、加入1/8體積的異丙醇，分成若干小份，置于鉛罐中，在-20℃以下的冰箱中貯存?zhèn)溆茫瑧?yīng)避免反復(fù)凍融。標(biāo)記抗原在貯存中是不穩(wěn)定的，這是因?yàn)椋阂皇敲摰�，�?biāo)記的碘從原來位置上脫落，變成游離碘；二是蛋白損傷、變性，成為聚合大分子或斷鍵成小分子碎片。由于上述原因，使B/F明顯降低，標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率變小，以致不能使用，故需分離純化，其方法是用SephadexG100長柱（40～80cm )過柱，洗脫后出現(xiàn)3個(gè)峰。第1個(gè)峰分子量大，是蛋白變性的聚合的大分子，尚保留部分抗原決定簇，免疫活性弱；第2個(gè)峰是純抗原的蛋白峰，免疫活性好；第3個(gè)峰是游離¹²⁵I或小分子碎片，不具備免疫活性。收集到的第2個(gè)純抗原蛋白峰，免疫活性好；第3個(gè)峰是游離¹²⁵I或小分子碎片，不具備免疫活性。收集到的第2個(gè)純抗原蛋白峰，其性能類似于新鮮標(biāo)記的抗原。分離純化的方法解決了標(biāo)記抗原的貯存、長期使用問題，特別對(duì)來之不易的抗原更顯得重要。

2．注意事項(xiàng)

（1)放射性碘源的選用：無載體的¹³¹I或¹²⁵I均可用于碘化標(biāo)記，但應(yīng)盡量選用新鮮的、比放射強(qiáng)度高的、含還原劑量少的放射性碘源。碘源的比放射強(qiáng)度最好≥50～100mCi/ml，至少也要>30mCi/ml，否則加入碘源的容量要增加，隨著帶入碘源中含有的還原劑（為放射性碘源運(yùn)輸保存所需加入)量也增加，這將會(huì)顯著降低碘利用率及標(biāo)記蛋白比放射強(qiáng)度。放置較久和放射性碘源，一方面因衰變致比放射強(qiáng)度降低，另一方面因水的輻射化學(xué)產(chǎn)物增多（主要是¹³¹I源)，都會(huì)降低標(biāo)記時(shí)的碘利用率。放射性碘源含還原劑（如Na₂S₂O₅等)量多時(shí)，會(huì)抵消氯胺T的作用，降低碘利用率，甚至導(dǎo)致標(biāo)記完全失敗。放射性碘源要用無載體的，標(biāo)記所用全部用具和試劑必須不含碘；只要有極少量的碘的污染，非放射性碘就會(huì)稀釋放射性碘，使放射性碘利用率顯著降低。為了便于放射性防護(hù)和除污染，以及減少射線對(duì)蛋白質(zhì)分子的損傷，標(biāo)記投入的放射碘量不宜過大，一般以<5mCi為宜。

（2)放射性碘與多肽、蛋白質(zhì)用量的比例：這比例對(duì)標(biāo)記結(jié)果的影響很大。如上述原因，一般標(biāo)記時(shí)放射性投入量不宜過多，示蹤實(shí)驗(yàn)室中常規(guī)每次只用1～2mCi，因而放射性碘與多肽、蛋白質(zhì)用量的比值主要靠標(biāo)記時(shí)投入的多肽、蛋白質(zhì)用量來控制。當(dāng)投入的放射碘量一定時(shí)，多肽、蛋白質(zhì)用量多（即I/多肽、蛋白質(zhì)比值低)，能獲得高碘利用率，但所得標(biāo)記蛋白比放射強(qiáng)度低；相反多肽、蛋白質(zhì)用量少（即I/多肽、蛋白質(zhì)比值高)，則碘利用率降低，但所得標(biāo)記多肽、蛋白比放射性隨此比值變化都有較大的變動(dòng)；而當(dāng)此比值<1后，則碘利用率再下降的幅率較小，標(biāo)記多肽、蛋白比放射性也不會(huì)再增加多少。

（3)氯胺T與偏重亞硫酸鈉的用量及碘化反應(yīng)時(shí)間：氧化碘化標(biāo)記法中，會(huì)導(dǎo)致失活的最主要原因是氧化還原。氯胺T是氧化劑，早期用氯胺T法作碘化標(biāo)記時(shí)氯胺T用量都比較大，或碘化反應(yīng)時(shí)間較長，結(jié)果導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和活性的嚴(yán)重?fù)p傷。氯胺T用量大，或長時(shí)間進(jìn)行碘化反應(yīng)，結(jié)果并不能使碘利用率和標(biāo)記多肽、蛋白質(zhì)比放射強(qiáng)度提高多少，反而使標(biāo)記多肽、蛋白活性下降。當(dāng)用不含還原劑或還原劑很少的放射性碘源時(shí)，試以各種蛋白質(zhì)（包括白蛋白、球蛋白、ACTH、胰島素等)作微量標(biāo)記，當(dāng)氯胺T用量為20μg/0.1ml反應(yīng)液、0～20^。C反應(yīng)20s，碘利用率都已接近或達(dá)到最大峰，再加大氯胺T用量和延長反應(yīng)時(shí)間是沒有必要的。隨放射性碘源中還原劑增多，氯胺T用量也應(yīng)增加，以達(dá)到預(yù)期的碘利用率，但決不應(yīng)盲目加大氯胺T用量和延長碘化反應(yīng)時(shí)間（通常反應(yīng)時(shí)間不要超過1min)，否則會(huì)導(dǎo)致標(biāo)記多肽、蛋白質(zhì)嚴(yán)重失活，不能用于實(shí)驗(yàn)。當(dāng)然，減少氯胺T用量要在了解放射性碘源還原劑含量的基礎(chǔ)上，否則碘源中還原劑量較多，雙盲目減少氯胺T用量，就會(huì)使標(biāo)記失敗。一般用¹²⁵I標(biāo)記時(shí)，氯胺T用量要適當(dāng)加大。加入氯胺T后必須迅速混勻，以防標(biāo)記不均勻。氯胺T與偏重亞硫酸鈉溶液要新配制的。

氯胺T用量減少了，Na₂S₂O₅用量也就可以隨之減少。為保證按時(shí)終止碘化反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)時(shí)加入Na₂S₂O₅一般都是過量的。氯胺T用量大時(shí)，加入Na₂S₂O₅的剩余量也就會(huì)隨之增加，這就可能加重某些對(duì)還原劑敏感的蛋白質(zhì)或多肽生物活性的損傷。為此，Na₂S₂O₅用量也不應(yīng)過多。只要藥品沒有變質(zhì)、試劑是新配的，以重量計(jì)算Na₂S₂O₅加入量與氯胺T相同就足以保證終止碘化反應(yīng)（按反應(yīng)克分子濃度計(jì)算，Na₂S₂O₅/氯胺T重量比約0.4)，不要盲目加大用量，并應(yīng)迅速將標(biāo)gydjdsj.org.cn/rencai/記多肽、蛋白質(zhì)從反應(yīng)液中分離出來，以盡量減少多肽、蛋白質(zhì)活性的損傷。

某些蛋白質(zhì)或多肽對(duì)氯胺T較敏感，還可進(jìn)一步減少氯胺T用量、縮短碘化反應(yīng)時(shí)間、降低反應(yīng)溫度，以保護(hù)蛋白質(zhì)的活性。這對(duì)一些較容易喪失活性蛋白質(zhì)或多肽的碘標(biāo)記十分重要。

（4)碘化反應(yīng)體積：系指加入Na₂S₂O₅終止反應(yīng)前液體的總量。碘化反應(yīng)體積愈小，局部反應(yīng)物濃度愈高，所得碘利用率和標(biāo)記多肽、蛋白比放射強(qiáng)度就愈高。所以，標(biāo)記應(yīng)采用比放射標(biāo)記效果。當(dāng)反應(yīng)液量少（<0.2～0.3ml)時(shí)，反應(yīng)體積對(duì)碘利用率和標(biāo)記多肽、蛋白質(zhì)比放射強(qiáng)度的高低影響較大；當(dāng)反應(yīng)液量大（>0.5～1.0ml)時(shí)則影響較小。微量氯胺T法放射碘標(biāo)記時(shí)，一般多控制碘化反應(yīng)體積<100μl。

（5)碘化反應(yīng)溫度：溫度升高，碘化反應(yīng)速度加快，碘利用率有所增加。但總的來看，反應(yīng)溫度的影響不很大，一般從0^℃到20℃碘利用率相差不過百分之幾，故一般在室溫下進(jìn)行標(biāo)記操作就可能獲得重復(fù)性好的結(jié)果。有些蛋白質(zhì)或肽類極易喪失活性，則可在0℃進(jìn)行碘化反應(yīng)。

（6)碘化反應(yīng)的pH值：受氧化劑氧化生成的活性碘，對(duì)多肽鏈的酪氨酸基苯環(huán)羥基鄰位的碘化作用，最適pH是7.3～7.8之間。當(dāng)pH變化時(shí)，碘化位置也會(huì)發(fā)生變化，例如pH值較高時(shí)，組氧酸的咪唑環(huán)也可被碘化；當(dāng)pH4～5時(shí)，活性碘能迅速氧化色氨酸基生成羥基吲哚，導(dǎo)致肽鏈斷裂。這些都會(huì)影響蛋白質(zhì)或多肽的放射性碘化反應(yīng)，或引起降解或失活。因此作放射性碘化標(biāo)記時(shí)，除放射性碘源外，所有的試劑都應(yīng)用適當(dāng)?shù)木彌_液配制，保證碘化反應(yīng)在最佳pH條件下進(jìn)行。

（7)微量蛋白質(zhì)或多肽的吸附損失：界面的吸附損失，在使用大量蛋白質(zhì)或多肽類時(shí)是可以忽略的，但作微量法標(biāo)記時(shí)投入的蛋白質(zhì)或多肽類只在微克甚至毫克甚至毫微克水平，界面吸附導(dǎo)致的損失就不能忽略。例如制備¹³¹I—ACTH時(shí)，所用ACTH濃度低到50Pg/ml時(shí)，因表面吸附可損失10%～30%，甚至高達(dá)75%。改變pH、加入非特異性載體蛋白、或使用聚苯乙烯、聚乙烯容器時(shí)，能減少吸附，但不能完全消除。一般殘留在反應(yīng)管和滴管上的放射性為投入總放射性的2%～8%、殘留在層析柱上折占5%～10%。殘留量隨標(biāo)記蛋白比放射性強(qiáng)度而直線增減，殘留者幾乎全部都是標(biāo)記蛋白。由此可見，微量蛋白質(zhì)或多肽受吸附而損失的量是不容忽略的。由于微量蛋白質(zhì)、多肽會(huì)被顯著吸附而丟失，所以標(biāo)記時(shí)投入蛋白質(zhì)、多肽量過微（如<2μg)也是不適宜的，否則標(biāo)記蛋白質(zhì)、多肽的收回率會(huì)太低，并在計(jì)算上會(huì)造成較大的誤差。

（8)不同蛋白質(zhì)、多肽碘化標(biāo)記的差別：由于不同的蛋白質(zhì)和多肽分子中含有的酪氨酸數(shù)目不同，而且其空間結(jié)構(gòu)也不相同，分子中的酪按酸殘基有的容易發(fā)生碘化反應(yīng)，有的就不容易碘化，因此同樣條件下進(jìn)行碘化標(biāo)記，不同蛋白質(zhì)或多肽對(duì)碘的利用率是不相同的。不同蛋白質(zhì)經(jīng)碘化標(biāo)記后生物活性受損的情況也各不相同。例如ACTH、促性腺激素釋放激素（GRH)、促黃體激素釋放激素（LRH)等多肽，碘化標(biāo)記后容易喪失激素活性或與受體結(jié)合的活性；而AFP及人絨毛膜促性腺激素（HCG)等的碘化標(biāo)記，則較容易保存良好的免疫化學(xué)活性。

盡管不同多肽、蛋白度的碘化標(biāo)記結(jié)果有所差別，但上述討論的因素對(duì)不同多肽、蛋白質(zhì)碘化標(biāo)記的影響有共同的規(guī)律。掌握了這些因素，就容易成功地獲得合格的標(biāo)記物。

不同多肽、蛋白質(zhì)的分子量大小、理化性質(zhì)各不相同，放射碘化標(biāo)記反應(yīng)后，可根據(jù)具體情況采取不同的方法將標(biāo)記蛋白質(zhì)（或多肽)與未反應(yīng)的游離放射性碘及受損傷的標(biāo)記物分開，常用的方法有凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析、各種電泳法等。

（二)乳過氧化物酶法（LPO)

本法反應(yīng)溫和，對(duì)抗原、抗體免疫活性影響小，已被廣泛應(yīng)用。缺點(diǎn)是標(biāo)記率較低，一般為20～40%。

1．原理此法是利用乳過氧化物酶（Lactoperoxidase)有促進(jìn)微量過氧化氫對(duì)¹²⁵I^-的氧化作用，生成¹²⁵I⁺，并標(biāo)記在多肽、蛋白質(zhì)酪氨酸分子上。

2．方法以標(biāo)記蛋白質(zhì)抗原為例。

（1)反應(yīng)液組成：蛋白質(zhì)2～5μg溶于磷酸緩沖液10～25μl中，加入Na¹²⁵i 1m Ci(10μl)、乳過氧化物酶溶液25ng(10μl)、H₂O₂200ng(10μl)；

（2)在室溫保溫7min；

（3)加入H₂O₂200ng(10μl)；

（4)過7min再加入H₂O₂(3μl)；

（5)保溫7min后，加入0.5ml、10mmol/L巰基乙醇以停止反應(yīng)；

（6)10min后加入NaI載體溶液1ml ；

（7)按常規(guī)方法分離純化。

3．注意事項(xiàng)

（1)LPO質(zhì)量好壞，可直接影響標(biāo)記率，LPO應(yīng)在使用前新鮮配制，以防酶活性降低。

（2)LPO用量應(yīng)小于總蛋白質(zhì)用量的1%，以減少酶自身碘化而帶入的放化雜質(zhì)。

（3)碘化反應(yīng)速率分析表明，酶的催化速度很快。

（4)碘化反應(yīng)在pH4.0～8.5較寬范圍內(nèi)均可進(jìn)行，最適pH值應(yīng)依據(jù)蛋白質(zhì)本身性質(zhì)而定。

（5)H₂O₂應(yīng)保持低濃度，如高于0.1mmol/L，對(duì)酶的活性將有抑制作用。

（三)Iodogen碘化法

此法具有標(biāo)記率高、反應(yīng)體積�。�3ml水平)、可用低濃度的¹²⁵I原料、對(duì)多肽激素和蛋白質(zhì)的免疫活性損失小、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，系常規(guī)的碘化方法之一。

1．原理　用Iodogen為氧化劑，對(duì)蛋白質(zhì)和多肽抗原進(jìn)行碘化標(biāo)記，把¹²⁵I直接引進(jìn)分子中的酪氨酸殘基上。標(biāo)記過程中被標(biāo)記樣品不與Iodogen混合，標(biāo)記后取出樣品即停止反應(yīng)，不使用任何還原劑。

2．方法

（1)標(biāo)記之前，先把Iodogen溶于有機(jī)溶劑，涂于管底，并使之干燥。

（2)標(biāo)記時(shí)，將蛋白質(zhì)溶液10～20μg/10μl(0.5mol/L,pH7.5PB)置于反應(yīng)管中，反應(yīng)管置于冰浴中。碘化時(shí)，¹²⁵I與蛋白質(zhì)克分子之比例為1～1.2。反應(yīng)時(shí)間在溫和的連續(xù)的攪拌下可達(dá)10min，從反應(yīng)管中轉(zhuǎn)移出反應(yīng)混合液，使其反應(yīng)停止。反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到含有200μl0.01mol/L、pH7.2PB和0.15mol/L NaCl溶液中，層析分離前再放置5min，使其未標(biāo)記的碘離子還原成分子碘，以避免在帶有緩沖液的柱中使白蛋白碘化。

3．注意事項(xiàng)

（1)涂有Iodogen的反應(yīng)管，有氮?dú)庵忻芊�，并貯存在-20^℃條件下，至少可用3個(gè)月。打開管，使用時(shí)間很短。

（2)碘化反應(yīng)時(shí)間，7min時(shí)標(biāo)記率達(dá)最高，10min時(shí)略有減少。PH6.0～8.5時(shí)，標(biāo)記率最高。

（3)Iodogen與蛋白質(zhì)的比率是標(biāo)記率的函數(shù)。最大的標(biāo)記率是1克分子的Iodogen與8克分子或再多量之比。

（四)�；�試劑（Bolton和Hunter試劑)法

1．原理這個(gè)方法用�；瘎�3--（4-羥苯基)丙酸—N琥珀酰胺酯（Bolton—Hunter試劑)做連接試劑，將¹²⁵I標(biāo)記在羥苯基的2，5位置上，再將琥珀酰胺酯水解，通過一個(gè)酰氨鍵將3--（4—羥基—5—¹²⁵I—苯基)接在蛋白或多肽的末端氨基上。

2．方法¹²⁵I—Bolton—Hunter試劑可用氯胺T法自行制備，出已有該試劑的苯溶液作為商品出售。使用時(shí)取一定量的標(biāo)記酯（μmol 蛋白用3～5μmol標(biāo)記酯)，用氮?dú)獯党�苯，投入欲�?biāo)記蛋白5～10μg及緩沖液10～50μl,pH8.0～8.5為宜，在冰浴中反應(yīng)15～30min后，加入多量氨基酸（如甘氨酸)，使過量標(biāo)記酯消耗掉以終止反應(yīng)。

此法避免了蛋白質(zhì)與氧化劑的接觸，又避免了與放射性碘原子的直接接觸，可防止碘源中有害物質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)的損傷，適用于標(biāo)記缺乏酪氨酸的蛋白質(zhì)或酪氨酸在活性中心，引入碘原子后會(huì)引起蛋白質(zhì)的失活。其缺點(diǎn)是標(biāo)記技術(shù)比較復(fù)雜，需要接觸較多的放射性，經(jīng)二步反應(yīng)，碘標(biāo)記率比較低。一般認(rèn)為此法不宜標(biāo)記短肽，而適于分子量大于1萬的蛋白質(zhì)。

三、放射性標(biāo)記化合物的純化與鑒定

（一)純化標(biāo)記化合物的常用方法

不論使用何種制備方法，要獲得合格的標(biāo)記化合物，都必須將反應(yīng)物經(jīng)過仔細(xì)的分離、純化。另外，一些標(biāo)記化合物，經(jīng)過一定時(shí)間的存放后，往往會(huì)出現(xiàn)不純物，而需再純化。如碘標(biāo)記生長激素（¹²⁵--HGH),在剛標(biāo)記的第2天，從Sephadex G-100過濾譜上可見，幾乎所有的碘化HGH都集中在峰II；保存1個(gè)月后，峰II組份減少，峰I和峰III成分明顯增加，峰I是集聚的標(biāo)記生長激素，而峰III是不具有免疫活性的放射性化學(xué)雜質(zhì)（圖8--3)。

圖8－3¹²⁵I—HGH的SephadexG-100過濾譜

實(shí)線：新鮮制備的¹²⁵I—HGH　虛線：保存1個(gè)月的¹²⁵I—HGH

標(biāo)記化合物的純化方法，除制備比活度低而化學(xué)量又較多的標(biāo)記物可用重結(jié)晶、蒸餾、萃取等常規(guī)方法外，一般需用微量分離技術(shù)，較方便的是層析法、離子交換法、凝膠過濾及高效液相層析法等�，F(xiàn)以碘標(biāo)記蛋白為例，說明以上各種方法的適用情況。

1．凝膠過濾法常用的是SephadexG系列，也有Biogel—P系列。分離標(biāo)記蛋白與無機(jī)碘時(shí)，通常用Sephadex G—25或G—50，然后用G—100進(jìn)一步純化。

2．離子交換法一般是制成離子交換層析柱，用于分離純化短肽標(biāo)記物。

3．透析法　能將標(biāo)記蛋白與小分子化合物很好地分離。

4．電泳法可用來分離單碘化、多碘化及已受損傷的蛋白質(zhì)。

5．親和層析法利用蛋白質(zhì)與其特異抗體或受體的結(jié)合來分離、純化標(biāo)記蛋白質(zhì)。此法特異性強(qiáng)，保持生物活性好，但操作較復(fù)雜。

6．高效液相層析法此法最大優(yōu)點(diǎn)是分離效果好、快速，但需特殊設(shè)備。

7．伴刀豆球蛋白A（ConA)吸附法ConA是一種植物凝集素，對(duì)糖蛋白有良好吸附能力，因此適于分離標(biāo)記糖蛋白。吸附的標(biāo)記糖蛋白可用含0.2mol/L甲基α-吡喃葡萄糖苷的PBS洗脫。

（二)標(biāo)記化合物的主要質(zhì)量指標(biāo)

作為示蹤劑及分析試劑的標(biāo)記化合物，應(yīng)具有比一般非標(biāo)記化合物更高的質(zhì)量要求。標(biāo)記化合物的質(zhì)量指標(biāo)包括：放射性核純度、放射化學(xué)純度、放射性比活度、生物活性和免疫活性以及標(biāo)記位置和定量分布情況等。

1．放射性核純度及其檢查方法

（1)放射性核純芳可用下式表示：

放射性核純度（%)=所需放射性核素的活度/樣品的總放射性活度×100

（2)放射性核純度的檢查方法：每一種核素都有它的特征，即物理半衰期及射線能量，故可通過半衰期及射線能量的測定來鑒別所需放射性核的純度。

①測定半衰期法：如短半衰期放射性核素，一般可采用時(shí)間跟蹤法，每隔一定時(shí)間測量放射性一次，共測3～5個(gè)半衰期，以每次測得的放射性計(jì)數(shù)為縱座標(biāo)，時(shí)間為橫座標(biāo)，在半對(duì)數(shù)紙上作圖，并通過分析，可求出該放射性核素的純度。

②測定射線能量法：利用每一放射性核素的特征射線譜來檢查放射性核純度。γ發(fā)射體可用γ能譜儀，如檢測⁵⁷Co和⁵⁸Co的核純度：純?chǔ)?發(fā)射體可用液閃儀，調(diào)節(jié)　道寬及淬火校正后，對(duì)如³H、¹⁴C、³²P的核純度進(jìn)行測量；而β、γ混雜垓素，則用吸收法測量，如^99mrTc中母體雜質(zhì)^99mMo的含量測量，是通過適當(dāng)厚度的鉛屏蔽，將^99mTc 發(fā)射的能量為141ke V的γ射線減弱后，測定⁹⁹Mo發(fā)射的能量為739Kev的γ射線。

2．放射化學(xué)純度及放化純度鑒定

（1)放射化學(xué)純度：放射性核素標(biāo)記化合物都是以一定的化學(xué)形態(tài)存在的，所以：

放射化學(xué)純度（%)特定化學(xué)形態(tài)的放射性活度/樣品總放射性活度×100

放射化學(xué)純度受制備方法及原料的化學(xué)純度、產(chǎn)物存放條件等影響，一般放化純度控制在95%以上。

（2)放射化學(xué)純度的測定方法：原則是高效的化學(xué)分離與靈敏的放射性測量相結(jié)合。常用下列方法：

①放射層析法，又稱放射色譜法：本法是利用色譜技術(shù)使混合物中各組份分離，然后測定各組份的放射性活度。它具有選擇性高、分離效果好、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，在放化純度鑒定中是一種重要的分析方法。最常用的是放射性紙層析法和放射性薄層層析法。

②放射性高效液相層析法：它對(duì)分離純化標(biāo)記化合物及鑒定標(biāo)記化合物的放化純度都有很大潛力，具有分析速度快、分離效率高、適用范圍廣等特點(diǎn)（幾乎80%的有機(jī)化合物均可應(yīng)用)。關(guān)鍵是要選擇合適的固定相和流動(dòng)相，使產(chǎn)品與雜質(zhì)分離。在流動(dòng)相中，被分析物各組份的濃度變化可用紫外或熒光檢測器檢測，而其放射性活度，可同時(shí)由放射性探測儀測定。放射性活度測定最簡單的一種辦法，是將洗gydjdsj.org.cn/wsj/脫液分部收集，然后在γ儀或液閃儀上進(jìn)行測量；另一種較理想的是連續(xù)測量，在洗脫液流通池外包圍一個(gè)固體閃爍探頭，進(jìn)行γ計(jì)數(shù)或在流通池前加一個(gè)三通混合室，用另一個(gè)泵混入閃爍液，測定軟β射線�？梢耘c紫外控測器的掃描圖，同步描繪出放射性的分布圖。

③放射性核素反稀釋法：取一定量（W₁)已測定比活度（S_O)的標(biāo)記化合物（約0.1～10mg)，用>1000倍化學(xué)量（W₂)的純載體稀釋，充分混勻后反復(fù)純化到比活度恒定不變（Sp)，此標(biāo)記化合物的放化純度值應(yīng)為：

有時(shí)該值>100%時(shí)，往往是由于所用載體化學(xué)純度不夠。因本法操作要求嚴(yán)格，一般不作常規(guī)放化純度鑒定用。

3．化學(xué)純度及化學(xué)量的測定標(biāo)記化合物中的非放射性化學(xué)雜質(zhì)雖一般不會(huì)對(duì)示蹤結(jié)果帶來直接干擾，然而這種雜質(zhì)的含量越多對(duì)標(biāo)記化合物在使用、存放過程中分解、變性的影響就越大。此外，也已發(fā)現(xiàn)某些標(biāo)記化合物的化學(xué)雜質(zhì)會(huì)給使用帶來直接影響。如用氚標(biāo)記類固醇作放射免疫分析試劑，其中的化學(xué)雜質(zhì)會(huì)影響標(biāo)記抗原與抗體的結(jié)合率，使分析靈敏度降低。因此，對(duì)標(biāo)記化合物的化學(xué)雜質(zhì)含量，同樣必須加以控制。

要制得化學(xué)純度的標(biāo)記化合物，最好是對(duì)可能產(chǎn)生的雜質(zhì)加以防止。這要在冷試驗(yàn)中解決。因?yàn)槔湓囼?yàn)所得產(chǎn)品是非放射性的，其化學(xué)純度可用常規(guī)方法，如溶點(diǎn)、沸點(diǎn)測定，NMR、紅外、紫外譜分析等手段加以鑒定，得到合格產(chǎn)品后，再按同樣方法及條件進(jìn)行標(biāo)記制備。

對(duì)于標(biāo)記化合物的化學(xué)含量，則必需在標(biāo)記反應(yīng)及一定純化步驟后進(jìn)行，由于需要高比活度的標(biāo)記化合物，往往樣品的放射性很強(qiáng)，而化學(xué)量極微（如某氘標(biāo)記化合物，分子量為300，每分子上標(biāo)記2個(gè)氘原子，氘的同位素活度為99.8%，則理論上每25mCi（925MBq)的化學(xué)量還不足（130μg),所以需用微量分析法才能測定其含量。一般而言，各種常規(guī)微量分析技術(shù)均可應(yīng)用。目前大多用紫外分光、熒光光度等進(jìn)行含量測定。

4．放射性比活度及其測定

（1)放射性比活度簡稱比活度，過去也稱比放射性。

比活度＝放射性活度／單位化學(xué)量

（2)比活度的理論值計(jì)算：每種放射性核素有一個(gè)比活度理論值，取決于該核素的半衰期和衰變常數(shù)。若N是1毫克原子（1mA)的總原子數(shù)，衰變常數(shù)λ（單位時(shí)間衰變的%)，則

任何元素每1mA的原子數(shù)都相同，等于阿伏加德羅常數(shù)，即6.023×10²⁰個(gè)，故

若T1/2min為單位，則上式的活度單位為dpm/mA,進(jìn)行單位換算后為：

根據(jù)上式，可計(jì)算出每種放射性核素比活度的理論值（常用放射性核素的比活度理論值見表8-2)。如果標(biāo)記化合物每分子接上一個(gè)放射性核素原子，則以上原論值亦為該標(biāo)記化合物的比活度（每毫摩爾的活度)理論值。

表8-2 一些常用放射性核素的比活度理論值

（亦即每分子一接一個(gè)該放射性核素原子的標(biāo)記化合物的經(jīng)活度理論值)

(3)放射性比活度測定方法

①直接測定計(jì)算法：將標(biāo)記產(chǎn)品經(jīng)分離純化后，配成合適的溶液，測定每毫升的放射性活度（如mCi/ml)及含量（μg/ml)從而計(jì)算其比活度。對(duì)于高經(jīng)活度的標(biāo)記物，化學(xué)含量甚低，一般需用光譜法，如紫外分光光度法測定其含量。

②層析掃描面積計(jì)算法：一般應(yīng)用紙層析或薄層層析，將反應(yīng)結(jié)果尚未分離的反應(yīng)液點(diǎn)樣、展層，然后在掃描儀上描繪放射性分布圖，根據(jù)描繪的面積來進(jìn)行計(jì)算，如圖8-4。

圖8-4　放射層析掃描面積計(jì)算比活度示意圖

₁為標(biāo)記物峰面積：

S₂S₃為雜質(zhì)峰及放射性原料峰面積

先計(jì)算標(biāo)記率：

放射性比活度的計(jì)算：若投入的待標(biāo)記物重量為W，且100%轉(zhuǎn)化為標(biāo)記物，則比活度=A·Y/W，其中A為投入的總放射性。

如果層析掃描儀有紫外監(jiān)測器和放射性活度計(jì)數(shù)率儀可同步測定掃描，則直接可給出比活度。

③自身取代計(jì)算法：這是間接測定標(biāo)記物比活度的方法。所測定的標(biāo)記物，需是分離純化后可用于RIA或RRA標(biāo)記試劑。

方法的原理是：作一條常規(guī)的RIA（或RRA)標(biāo)準(zhǔn)曲線，另作一條不加非標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)品，只加抗體和不同量標(biāo)記試劑的自身取代曲線。兩者用同一種抗體，且抗體用量完全相同。若反應(yīng)平衡后測定結(jié)合部分的放射性，掏算成所加總放射性（注意：對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線總說總放射性各管相同，對(duì)自身取代曲線來說各管不同，需分別換算)的百分?jǐn)?shù)，即結(jié)合率B。由于兩條曲線所用抗體的質(zhì)和量嚴(yán)格相同，標(biāo)記物與非標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)品與抗體親和力也相同，故B的大小就完全取決于各管中標(biāo)記物和非標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)品的總量。亦即若從兩標(biāo)準(zhǔn)曲線上取一點(diǎn)相同的B，則

（標(biāo)記物+標(biāo)準(zhǔn)品)_{標(biāo)準(zhǔn)曲線}=（標(biāo)記物)_{自身取代曲線}

故由此便可直接計(jì)算標(biāo)記試劑的化學(xué)含量并進(jìn)一步求得比活度。為求準(zhǔn)確度高，可取我點(diǎn)B求出平均比活度。

用自身取代法測定標(biāo)記化合物的比活度，只適用于RIA的標(biāo)記抗原及受體的標(biāo)記配基。使用時(shí)應(yīng)注意：①標(biāo)記物與未標(biāo)記物對(duì)抗體（受體)的親和力應(yīng)相同；②非特異性結(jié)合應(yīng)較小，且計(jì)算時(shí)應(yīng)扣除；③制備標(biāo)準(zhǔn)曲線與自身取代曲線時(shí)，操作步驟應(yīng)相同，特別是B與F分離的條件要一致。

5．生物活性、免疫活性測定

（10)生物活性、免疫活性測定的重要性：放射性標(biāo)記化合物作為示蹤劑用于生物體內(nèi)的示蹤研究，或作為分析試劑用于生物活性物質(zhì)分析，都要求標(biāo)記化合物不改變其原有的生物活性和免疫活性。當(dāng)給化物引入放射性原子，即使“同位素標(biāo)記”大多需經(jīng)過原子交換或化學(xué)反應(yīng)及分離純化等物理化學(xué)處理，有可能造成光學(xué)構(gòu)型及立體構(gòu)型的改變而使標(biāo)記物改變性質(zhì)�！胺峭�位素標(biāo)記”，如蛋白質(zhì)分子中引入碘原子，則更易引起蛋白質(zhì)失活、變性。故測定放射性標(biāo)記化合物的生物活性和免疫活性，對(duì)保證使用效果十分必要。

（2)生物活性和免疫活性測定的要求：需根據(jù)使用要求而定，因?yàn)橥�一�?biāo)記物其生物活性的變化與免疫活性的變化不一定相關(guān)；同一標(biāo)記激素，其與受體結(jié)合能力的改變與抗體結(jié)合能力的改變也不一定平行。

（3)測定方法：測定標(biāo)記蛋白質(zhì)或多肽的生物活性和免疫活性常用的方法有下述幾種：

①物理化學(xué)方法：可用電泳法、吸附法及凝膠過濾法等物理化學(xué)方法來測定標(biāo)記蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變情況，如標(biāo)記后受損全傷的蛋白質(zhì)在電泳時(shí)泳動(dòng)性減少，碘化受損的多肽激素在血紅蛋白涂碳上的吸附性質(zhì)也有改變，而蛋白質(zhì)變性聚合時(shí)大分子聚合體將在凝膠過濾時(shí)不停留在凝膠柱上。這些測定雖較快速方便，但對(duì)標(biāo)記物的生物活性和免疫活性的嚴(yán)格判定來說，還是很不夠的。

②特異結(jié)合試驗(yàn)：根據(jù)放射性標(biāo)記化合物用于放射免疫分析等不同要求，分別與其相應(yīng)抗體或受體進(jìn)行特異性結(jié)合試驗(yàn)。以放射免疫分析試劑為例，測定其免疫活性的方法是：先觀察標(biāo)記物與抗體的結(jié)合率，如果結(jié)合率高，說明抗原的免疫活性較好。進(jìn)一步觀察標(biāo)記抗原與非標(biāo)記對(duì)抗體親合力是否一致，做法之一是用不同稀釋度的抗體，分別與標(biāo)記抗原及與標(biāo)記抗原加非標(biāo)記抗原的混合物進(jìn)行特異結(jié)合，其中混合物抗原總濃度要和單獨(dú)使用放射性抗原的濃度相同。如單獨(dú)使用標(biāo)記抗原1.0ng,而混合抗原的總濃度亦為1.0ng，其中標(biāo)記抗原為0.1ng，非標(biāo)記抗原為0.9ng，比較兩者的結(jié)合率，如果基本相同，說明標(biāo)記抗原保持其原來的親和力，在標(biāo)記等操作過程中未受到明顯損傷。如圖8-5中，A線與B線基本平行；如果標(biāo)記抗原免疫活性已有降低，則如C線所示。

圖8-5　標(biāo)記蛋白的免疫活性測定

A；為標(biāo)記抗原與血清的滴度曲線B：為非標(biāo)記抗原（加入少量標(biāo)記抗原)的滴度曲線；C：與A相同，但標(biāo)記抗原免疫活性已有降低

③生物特性測定：如¹²⁵I—纖維蛋白原，可用凝血酶測定其可凝能力，與非標(biāo)記物相比，視是否有改變。使用何種生物特性測定，根據(jù)標(biāo)記物的生物性質(zhì)而定。另外，上述特異性結(jié)合試驗(yàn)，如果受體作異結(jié)合劑，也是檢驗(yàn)用作RRA或RBA分析試劑的標(biāo)記物生物活性情況的有效方