免疫細(xì)胞化學(xué)的發(fā)展對許多領(lǐng)域的研究起到很大的推動作用，在神經(jīng)科學(xué)的研究中尤為突出。本章 僅就免疫細(xì)胞化學(xué)在神經(jīng)科學(xué)的基礎(chǔ)研究方面的應(yīng)用做一簡要介紹。
早期的神經(jīng)科學(xué)工作者應(yīng)用傳統(tǒng)的神經(jīng)解剖學(xué)研究方法如甲基藍(lán)染色法、鍍銀染色法等對中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)做了大量的研究工作，但由于技術(shù)方法的限制，對神經(jīng)遞質(zhì)的性質(zhì)無法確定。1949年Koelle建立了膽堿酯酶染色法（cholinesterase staining method, ChE)1964Rh ，Karnovsky 和Roots在此基礎(chǔ)上改良并建立了一步完成的乙酰膽堿酯酶（Acetycholinesterase,AChE)直接染色法，使顯示膽堿能神經(jīng)成為可能。從生物測定來看，AchE和膽堿能神經(jīng)的標(biāo)志酶存在平行關(guān)系。因此，一般認(rèn)為，在加用乙酰膽堿酯酶抑制劑的情況下，用Ache 顯示膽堿能神經(jīng)，仍不失為一種簡便易行、可信的技術(shù)方法。但必須指出的是，一些接受膽堿能神經(jīng)支配的細(xì)胞（稱為膽堿能敏感細(xì)胞)和一些非神經(jīng)細(xì)胞（如紅細(xì)胞和骨骼肌)也可呈AchE陽性反應(yīng)，甚至中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)去甲腎上腺素（NA)能神經(jīng)元集中的部位—藍(lán)斑也呈現(xiàn)AchE陽性反應(yīng)。因此，AchE陽性反應(yīng)的不能就簡單地確定為膽堿能神經(jīng)元或神經(jīng)。
50年代，Eranko就已發(fā)現(xiàn)用甲醛水溶液可使腎上腺髓質(zhì)內(nèi)含NA的神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生熒光。瑞典的Falck和Hillarp（1962)在此基礎(chǔ)上改良并建立了用冷凍干燥和甲醛蒸汽誘發(fā)熒光，1974年Lindvall 和Bjorklund（1974)和de la Torre等（1976)相繼建立和改良了乙醛酸誘發(fā)熒光法，開展了熒光組織化學(xué)的新篇章 ；為研究單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的定位和分布提供了手段。
70年代以來，免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，使我們在對上述經(jīng)典神經(jīng)遞質(zhì)研究的基礎(chǔ)上又邁進(jìn)了一大步。與上述方法相比，免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)具有較高的敏感性和特異性，例如應(yīng)用膽堿能神經(jīng)元的標(biāo)志酶—膽堿乙酰移換酶（Choline acetylase, ChAc)的單克隆抗體就能較AChE法更準(zhǔn)確地確定膽大能神經(jīng)元，同樣，應(yīng)用多巴胺羥化酶（DβH)抗血清能較甲醛或乙醛酸誘發(fā)熒光法更為準(zhǔn)確地研究NA神經(jīng)元及其通路，而且不需借助顯微分光光度計測定各種單胺遞質(zhì)呈現(xiàn)熒光的不同波長加以區(qū)別，免疫細(xì)胞化學(xué)應(yīng)用不同的標(biāo)志酶免疫染色就可區(qū)別各種神經(jīng)元和/或確定神經(jīng)元內(nèi)所含的不同的神經(jīng)遞質(zhì)。如DβH免疫反應(yīng)陽性在哺乳動物即可做為NA能神經(jīng)元的標(biāo)志，因為哺乳動物不存在其它合成NA的酶，所有合成NA的部位均有DβH。酪氨酸羥化酶（TH)和多巴脫羧酶（DDC)陽性表示多巴胺（DA)能神經(jīng)元系統(tǒng)，而TH，DDC，DβH和苯乙醇胺位甲基移酶（PNMT)免疫反應(yīng)陽性即為腎上腺素（E)能神經(jīng)元系統(tǒng)。
借助免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)，至目前為止，還發(fā)現(xiàn)了有40種以上的神經(jīng)肽分布于中樞神經(jīng)、下丘腦、垂體、松果體、脊髓、神經(jīng)節(jié) 及外周神經(jīng)系統(tǒng)特定的神經(jīng)元中。在脊椎動物，這些肽類物質(zhì)在體內(nèi)的分布呈多位性，不局限于神經(jīng)組織或神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)，如原先在腦或下丘腦、垂體中提取的神經(jīng)肽如腦啡肽（ENK)、生長抑素（SOM)和血管活性腸肽（VIP)等也存在于消化道的內(nèi)分泌細(xì)胞和壁內(nèi)神經(jīng)叢中，反之，一系列先從胃腸道分離的肽類激素如膽囊收縮素（CCK)、P物質(zhì)（SP)等也在神經(jīng)組織中發(fā)現(xiàn)，如CCK在人和豬大腦皮質(zhì)含量非常豐富，達(dá)11nmol/每克腦組織，P物質(zhì)在腦中30處以上的地方存在，這些多肽被稱之為腦腸肽（brain gut peptides)。在外周器官如消化道、呼吸道中的肽類物質(zhì)統(tǒng)稱為調(diào)節(jié) 肽（regulatory peptide)，包括存在于消化道與呼吸道等器官內(nèi)分泌細(xì)胞內(nèi)的多肽（在消化道又稱胃腸激素)和存在于器官壁內(nèi)神經(jīng)叢中的神經(jīng)肽。雖然神經(jīng)肽，包括腦腸肽在機(jī)體中的確切生理作用還有待研究，是作為神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)調(diào)制物（neuromodulator )或神經(jīng)激素（neurohormone)或二者兼而有之，還存在爭論。但免疫細(xì)胞化學(xué)在神經(jīng)科學(xué)中的應(yīng)用已為我們開辟了一個新的研究領(lǐng)域，它確定在機(jī)體中除傳統(tǒng)的膽堿能神經(jīng)和腎上腺素能神經(jīng)以外還存在第三上分枝—非腎上腺素能非膽堿能神經(jīng)（non—adrener－gic non –cholinergic nerves, NANC)。Bloom等認(rèn)為這第三種神經(jīng)成分其末梢釋放的遞質(zhì)是多肽類物質(zhì)，又稱www.med126.com肽能神經(jīng)（Peptidergic nerves)。研究結(jié)果表明，機(jī)體全身的各個器官內(nèi)都有不同種類和不同數(shù)量的肽能神經(jīng)分布。在大鼠和丘腦下部、杏仁復(fù)合體，延腦內(nèi)一些神經(jīng)核和脊髓后角內(nèi)均有較多的肽能神經(jīng)元和纖維，小腦內(nèi)僅有散在的肽能神經(jīng)纖維，而大腦皮質(zhì)內(nèi)多數(shù)神經(jīng)肽缺如，僅發(fā)現(xiàn)有CCK、SOM和VIP等數(shù)種。在消化道，存在一個壁內(nèi)神經(jīng)系統(tǒng)，Langley 稱為胃腸神經(jīng)系統(tǒng)（Enteric Nenvous System)，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)其中含有VIP、SP、ENK、SOM等20余種神經(jīng)肽，其它各臟器中也都有肽能神經(jīng)分布。
免疫細(xì)胞化學(xué)可作為組織探針（Histological probe )，不斷探查和發(fā)現(xiàn)新的神經(jīng)遞質(zhì)。除上述的乙酰膽堿及其合成酶、腎上腺素及其合成酶、活性多肽以外，還可用以確定其它的疑義神經(jīng)遞質(zhì)（Neurotransmitter chemical suspect)的性質(zhì)和分布，包括5—HT及其有關(guān)酶類、γ—氨基丁酸（GABA)、甘氨酸、天門冬氨酸和牛磺酸等。
近年來，重組DNA工程與免疫細(xì)胞相結(jié)合而發(fā)展起來的原位雜交免疫細(xì)胞化學(xué)（In situhybridizationImmunocytochemistry)作為組織探針，在發(fā)現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)特有的蛋白質(zhì)和肽類方面。具有更高的特異性和靈敏性。重組DNA工程系列用制備的腦的多聚腺苷酸的mRNA，反轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNa （cDNA)，克隆后與組織切片中的mRNA雜交，再按其cDNA核苷酸順序推斷出氨基酸順序合成新的多肽，以此作為抗原，制備抗血清進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)的研究，以發(fā)現(xiàn)新的神經(jīng)肽。原位雜交免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)，簡言之，就是利用放射性同位素（或生物素)標(biāo)記的cDNA片段與組織或細(xì)胞中特異的mRNA進(jìn)行雜交來觀察mRNA在體內(nèi)的分布（詳?shù)诙隆?。發(fā)展這項技術(shù)，對發(fā)現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)特有的蛋白質(zhì)或肽類，具有極大的潛力，如腦內(nèi)特有的mRNA有30000種，目前已知的數(shù)10種神經(jīng)肽僅占其中的一小部分。
免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的引入，使神經(jīng)解剖學(xué)追蹤神經(jīng)束的行徑及其投射區(qū)的研究方法從單純的采用損毀核團(tuán)或壓榨、切斷神經(jīng)不引起潰變，然后用鍍銀或其它染色法觀察潰變的神經(jīng)細(xì)胞體和末梢這一傳統(tǒng)的技術(shù)中解脫出來。與70年代的HRP技術(shù)和放射性自顯影術(shù)相比，免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)不但能追蹤神經(jīng)束的行徑及其投射區(qū)，而且可以定性，確定神經(jīng)細(xì)胞核團(tuán)或神經(jīng)束所含神經(jīng)遞質(zhì)的種類。量單純用免疫組化染色在連續(xù)切片上追蹤，常不能獲滿意結(jié)果，因為神經(jīng)組織的多肽含量較低，在免疫組化染色的連續(xù)切片追蹤過程中常有丟失的可能。故現(xiàn)在普遍采用的是免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)與其它技術(shù)相結(jié)合的“雜交技術(shù)”，如與HRP、熒光物和放射自顯影技術(shù)等相結(jié)合的逆行或順行標(biāo)記法、與AChe 和單胺熒光組織化學(xué)技術(shù)相結(jié)合的多重染色法等。Westlund1983年應(yīng)用DβH抗血清注入脊髓，經(jīng)軸漿運輸?shù)桨w，證明腦橋的NA能神經(jīng)細(xì)胞群是脊髓內(nèi)NA能神經(jīng)纖維和終末的唯一來源。利用免疫熒光與熒光素進(jìn)行標(biāo)記相結(jié)合的方法，Mathy 和Hunt查清了過去一直了解得不太清楚的內(nèi)臟感覺和味覺的傳入徑路，證明在內(nèi)臟感覺和味覺由周圍感受器傳導(dǎo)至感覺皮質(zhì)，中繼部位在延髓的孤束核，腦橋的解剖學(xué)工作者還發(fā)現(xiàn)用麥胚凝集素（WGA)或霍亂毒素（Cholera Toxin)結(jié)合的HRP（CT—HRp )，在神經(jīng)束行徑追蹤方面，較游離的HRP靈敏數(shù)10乃至100倍以上，因為結(jié)合的HRP是通過受體介導(dǎo)而被神經(jīng)元攝入的。萬選才等的研究工作表明CT-HRP較之單純的HRP在顯示樹突終末狀結(jié)構(gòu)方面有很高的靈敏性。結(jié)合HRP的優(yōu)點可歸結(jié)為四點：①靈敏度高；②劑量低微；③充分、恒定地顯示軸突、樹突順行（離胞體)標(biāo)記；④降解時間長。以古老的切斷神經(jīng)或損毀神經(jīng)細(xì)胞核團(tuán)的研究方法與免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)相結(jié)合以追蹤神經(jīng)細(xì)胞的起源仍在沿用，如Hokfelt在研究小腸SOM免疫反應(yīng)性神經(jīng)的來源時發(fā)現(xiàn)，切除腸系膜神經(jīng)后，小腸SOM免疫反應(yīng)性神經(jīng)減少，而結(jié)扎腸系膜神經(jīng)后DβH和SOM免疫反應(yīng)物在結(jié)扎的神經(jīng)近端聚集，說明小腸的DβH和SOM主要是通過腸系膜神經(jīng)傳運來腸壁的。也可采用化學(xué)神經(jīng)阻斷劑如6—羥多巴胺（6--OHDA)、紅辣椒素（Capsaicin)等代替手術(shù)切斷，與免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)結(jié)合應(yīng)用探尋神經(jīng)束的行徑和反射。
總之，免疫免疫化學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，使能在中樞較前更迅速、準(zhǔn)確地顯示了一些神經(jīng)束的行徑、神經(jīng)細(xì)胞核團(tuán)的定位和定性以及外周器官神經(jīng)纖維的來源等。
免疫細(xì)胞化學(xué)的發(fā)展進(jìn)一步揭示了神經(jīng)組織成分的特殊化學(xué)性質(zhì)，利用這些特征不僅能區(qū)別神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞，而且可進(jìn)一步區(qū)分不同的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。S—100是一種從腦組織提取出來的酶性蛋白，是鈣結(jié)合蛋白的一種，它主要存在于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、周圍神經(jīng)的雪旺氏細(xì)胞、交感神經(jīng)節(jié) 中的衛(wèi)星細(xì)胞和腸肌間神經(jīng)叢的腸膠質(zhì)細(xì)胞（Entericglial cell)。S—100 也可用于人類腫瘤組織發(fā)生的分類，如星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤雪旺氏細(xì)胞瘤顯示S—100免疫反應(yīng)陽性而腦膜瘤和髓母細(xì)胞瘤為陰性反應(yīng)。神經(jīng)元特異性烯醇化酶（Neuron-specific Enolase, NSE)是從腦組織分離出的一種酸性可溶性蛋白，是烯醇酶的同工酶之一。NSE是神經(jīng)元特異性蛋白質(zhì)，存在于神經(jīng)細(xì)胞和APUD系統(tǒng)的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中，可作為神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的標(biāo)志酶，在星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤、腦室管膜瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、腦膜瘤和雪旺氏細(xì)胞瘤中，NSE呈免疫反應(yīng)陰性，而神經(jīng)母細(xì)胞瘤為NSe 免疫反應(yīng)陽性。皮膚的Marker細(xì)胞，細(xì)胞學(xué)分類歸屬不明，經(jīng)NSE免疫染色反應(yīng)呈陽性結(jié)果，結(jié)合電鏡觀察證明在該類細(xì)胞中含有致密核心的大囊泡，屬APUD系統(tǒng)的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞。在APUD系統(tǒng)的其它細(xì)胞如垂體前葉中肽類細(xì)胞、腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞等以及APUD瘤中，NSE均呈陽性反應(yīng)。NSE又是神經(jīng)元分化的標(biāo)志酶，可以用以研究體內(nèi)、外神經(jīng)元的分化發(fā)育過程。
近來，免疫細(xì)胞化學(xué)工作者又利用各種細(xì)胞中所含中間絲提純制成特異性的單克隆抗體血清用于細(xì)胞學(xué)歸屬和病理學(xué)的檢測。這些中間絲包括：①上皮細(xì)胞或上皮源細(xì)胞中的前角質(zhì)蛋白（Prekeratin)或稱細(xì)胞角質(zhì)蛋白（cytokeratin)；②心肌、平滑肌或骨骼肌細(xì)胞中的結(jié)蛋白（Desmin)；③間質(zhì)細(xì)胞或間充質(zhì)細(xì)胞中的波形微絲（Vimentin)；④神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的膠質(zhì)纖維酸性蛋白（Glial Fibrillory Acidic Protein,GFAP)；⑤神經(jīng)細(xì)胞中的神經(jīng)微絲（Neurofilament, NF)等（詳見第十二章 )。實驗證明，GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白，具有星形膠質(zhì)細(xì)胞分化潛能的腫瘤如髓母細(xì)胞瘤也含有GFAP，而少突膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞呈陰性反應(yīng)。腸道肌間神經(jīng)絲內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞原來細(xì)胞學(xué)分類歸類不明，經(jīng)GFAP染色呈陽性反應(yīng)，說明其中與中樞星形膠質(zhì)細(xì)胞屬于同一細(xì)胞學(xué)范疇。O1—O4抗原和半乳糖腦苷脂（Galactocerebroside)只存在于少突膠質(zhì)細(xì)胞，griffonia simplicifloia凝集素僅對小膠質(zhì)細(xì)胞呈陽性反應(yīng)（小膠質(zhì)細(xì)胞膜上有2—d –半乳糖)。據(jù)此，可區(qū)分不同類型的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。
總之，免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的發(fā)展，解決了過去依賴Nissl 、Cajal和Golgi等傳統(tǒng)的神經(jīng)組織染色法所不能完全解決的問題。進(jìn)一步揭示了神經(jīng)細(xì)胞的特殊化學(xué)性質(zhì)，現(xiàn)在神經(jīng)組織內(nèi)已證實的物質(zhì)包括蛋白質(zhì)、肽類、酶類、神經(jīng)遞質(zhì)和胺等不下50余種，其中神經(jīng)系統(tǒng)的特異性蛋白質(zhì)有20余種，與神經(jīng)元有關(guān)的除NSE外，還有神經(jīng)微絲蛋白，微管蛋白，堿性蛋白（只存在于大腦神經(jīng)元內(nèi)的一種組蛋白)和只存在于嗅球神經(jīng)元中的嗅球蛋白等；與神經(jīng)膠質(zhì)有關(guān)的有：神經(jīng)收縮蛋白、小泡蛋白、突觸蛋白（Synaptin)、GP350和D1、D2、D3等，為進(jìn)一步研究神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞及其結(jié)構(gòu)成分提供了有力的手段。
應(yīng)用免疫電子顯微鏡技術(shù)（常用為PAP法或膠體金標(biāo)記技術(shù))可顯示抗原在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的超威結(jié)構(gòu)定位及在突觸水平神經(jīng)元間的聯(lián)系的化學(xué)本質(zhì)。Pickel應(yīng)用免疫電鏡觀察證明TH存在于DA和DA能神經(jīng)元的細(xì)胞體、樹突和近側(cè)軸突。在胞體內(nèi)此酶定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、Golgi器和微管上。神經(jīng)終末枝的突觸小泡一般認(rèn)為是神經(jīng)遞質(zhì)的亞細(xì)胞貯存部位，在電鏡下觀察神經(jīng)末梢內(nèi)突觸小泡呈現(xiàn)不同形態(tài)，目前已有文獻(xiàn)報道的近10余種，比較常見的為無顆粒小泡型（Small agranular vesicles , SAV)或稱清亮小泡型（SmallClear Vesicles, SCV)，其直徑50～90nm，中心無顆粒（圖11-1E)；該型常混有不同比例含致密核心的大囊泡，直徑80～150nm。其次是顆粒小囊泡型（Small granular vesicles, SGV)，直徑45～70nm，內(nèi)含有電子密度高的致密核心（圖11-1A)。第三是大顆粒泡型（large granular vesicles, LGV)，直徑80～160nm的突觸小泡內(nèi)含有電子密度高的致密核心（圖11-1B)。其它還有扁平囊泡型、線粒體型等（圖11-1)。是否不同形態(tài)的突觸小泡代表了含有不同種類的神經(jīng)遞質(zhì)尚有爭論。有學(xué)者認(rèn)為不同形態(tài)的突觸小泡只是使用不同種類固定液的人工假象，然而越來越多的實驗證明表明，固定液的種類固然有一定影響，但神經(jīng)終末突觸小泡的形態(tài)和內(nèi)含遞質(zhì)的種類似乎存在一定的相關(guān)性，SAV型是取得比較一致意見的神經(jīng)終末類型，它和骨骼肌運動終板（也是神經(jīng)—肌肉的突觸)內(nèi)所含突觸小泡的形態(tài)相一致，后者已證明為乙酰膽堿神經(jīng)遞質(zhì)的貯存處，細(xì)胞化學(xué)示Ach陽性反應(yīng)，電刺激時突觸小泡減少，示釋放現(xiàn)象。這種類型的突觸小泡內(nèi)可能含有乙酰膽堿。
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圖11-1 神經(jīng)末梢突觸中囊泡類型
SGV型一般認(rèn)為是單胺介質(zhì)的貯存部位，單胺類介質(zhì)。包括兒茶酚胺和吲胺二種，屬于前者的介質(zhì)有去甲腎上腺素、多巴胺、腎上腺素、屬于后者的介質(zhì)為5—HT。在常規(guī)電鏡生物樣品處理的過程中，小顆粒囊泡不易顯示，須應(yīng)用0.1mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.0)配制的3%高錳酸鉀溶液（Richardson1966)或鉻酸鹽/重鉻酸鹽溶液（Tranzer 1976)固定，方能獲得滿意結(jié)果。認(rèn)為SGV是單胺遞質(zhì)貯存部位的根據(jù)是：用利血平注射能使小泡內(nèi)致密核心消失，而用偽介質(zhì)（Pseudo—neurotransmitter )如5-羥多巴胺（5—OHDA )注射動物，由于偽介質(zhì)能置換內(nèi)源性單胺而被吸收和貯存于突觸囊泡中，末梢中小顆粒囊泡的數(shù)目增加，電刺激交感神經(jīng)可使小顆粒囊泡減少，而將α甲基去甲腎上腺素給予被擬交感神經(jīng)藥物或被電刺激耗竭了介質(zhì)的動物，其神經(jīng)末梢中的小顆粒囊泡又可重新出現(xiàn)。但1982年Wilson等應(yīng)用多種實驗證明，至少在小腸肌間神經(jīng)叢內(nèi)，腎上腺素能神經(jīng)的終末支是扁平無顆粒囊泡型（flat agranular vesicles, FAV)，而不是SGV型。1965年Taxi在兩棲類動物的腸道中發(fā)現(xiàn)含大顆粒囊泡的神經(jīng)終末支LGV，Baumgarten(1970)在哺乳動物腸道也發(fā)現(xiàn)了LGV型神經(jīng)終末支，因其形態(tài)與丘腦下部含肽的神經(jīng)末支相似，故命名為P型神經(jīng)終末支，意即肽能神經(jīng)（Peptidergic nerves)終末支，而有作者認(rèn)為凡是顆粒囊泡，包括SGV和LGV都是單胺類遞質(zhì)的貯存部位。免疫電鏡技術(shù)部分地解決了這一爭論。應(yīng)用PAP和膠體金免疫電鏡技術(shù)證明VIP、SP、降鈣基團(tuán)相關(guān)肽（CGRP)和神經(jīng)肽Y（NPY)等多肽類物質(zhì)確實定位于大顆粒囊泡中（Larsson 1976, Bishop 1982, Probertet al, 1983)。有作者還認(rèn)為不同種類的多肽分別被包含于不同直徑的大顆粒囊泡中，如SP定位于直徑85nm的大顆粒囊泡中；VIP：囊泡直徑98nm；ENK：囊泡直徑110nm等，但不同作者在不同動物種屬和不同組織、應(yīng)用方法不同報告結(jié)果各異，難以結(jié)論。Fried（1985)應(yīng)用免疫組化、電鏡技術(shù)和密度梯度離心法相結(jié)合，證明在大鼠輸精管神經(jīng)終末支小顆粒囊泡中含有NA，而大顆粒囊泡分為三種類型：單純含NPY或NA，或NA與NPY共存于一個囊泡中。Burnstock還提出gydjdsj.org.cn/wszg/直徑100～200nm的大的不透明囊泡（LOV型)系嘌呤能神經(jīng)遞質(zhì)的貯存部位（圖11-1，G)，神經(jīng)終末支內(nèi)全為線粒體所充滿的可能屬感覺神經(jīng)終末支（圖11-1，H)。凡此種種，都說明雖然免疫電鏡提供了神經(jīng)遞質(zhì)超微結(jié)構(gòu)水平定位定性的可能，但神經(jīng)終末內(nèi)突觸小泡的形態(tài)與神經(jīng)遞質(zhì)種類之間的關(guān)系始終還有待于進(jìn)一步的研究。如SAV型在外周可能是代表膽堿能神經(jīng)的終末支，在中樞能否說SAV內(nèi)所含的都是乙酰膽堿，其它各型的突觸小泡內(nèi)所含神經(jīng)遞質(zhì)的種類也還需要進(jìn)一步研究。在技術(shù)方法上的運用，根據(jù)筆者體會，應(yīng)用免疫電鏡PAP法，免疫反應(yīng)復(fù)合物相當(dāng)大，有時很難準(zhǔn)確地判斷免疫反應(yīng)復(fù)合物的定位，因在囊泡基質(zhì)內(nèi)和囊泡膜上雹有反應(yīng)物附著，免疫膠體金電鏡技術(shù)避免了上述缺點，膠體金顆粒的沉積比較集中于囊泡基質(zhì)內(nèi)，在遞質(zhì)超微結(jié)構(gòu)定位的研究上似較PAP法優(yōu)越。
免疫細(xì)胞化學(xué)在神經(jīng)科學(xué)的運用打破了傳統(tǒng)的一個神經(jīng)細(xì)胞只產(chǎn)生和釋放一種神經(jīng)遞質(zhì)的概念。在中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)，近年來，有較多的實驗報告證明在一個神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)存在兩種或兩種以上的遞質(zhì)，這種遞質(zhì)共存不是偶然和個別的現(xiàn)象，而是一種帶普遍規(guī)律的問題。在光鏡水平顯示神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)兩種抗原的共存，其分辨率只限于胞體，觀察神經(jīng)纖維內(nèi)兩種抗原的共存，必須借助免疫電鏡技術(shù)。共存情況可出現(xiàn)于：（1)經(jīng)典神經(jīng)遞質(zhì)間，如在大鼠頸上交感神經(jīng)節(jié) 的相鄰照片上，同一神經(jīng)細(xì)胞分別顯示NA和ACh陽性；（2)經(jīng)典遞質(zhì)與單胺類遞質(zhì)間，如在松果體交感神經(jīng)末梢中，不僅含有NA，而且含有5—HT；（3)經(jīng)典遞質(zhì)和神經(jīng)肽間，如在大鼠的椎前神經(jīng)節(jié) 中，大約有60%的NA能神經(jīng)細(xì)胞同時顯示SOM免疫反應(yīng)陽性，說明SOM與NA的共存，在交感神經(jīng)系統(tǒng)中NPY與NA的共存，在副交感神經(jīng)系統(tǒng)中VIP與ACh的共存，已得到較為普遍的證實；（4)單胺類遞質(zhì)與神經(jīng)肽的共存，如大鼠輸精管的交感神經(jīng)終末支中NA與NPY的共存，在豚鼠腸道肌間神經(jīng)節(jié) 中5—HT與SP免疫反應(yīng)物共存一個神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)，和（5)神經(jīng)肽間的共存，如SP與CGRP常共存于感覺神經(jīng)終末支，Gibbins等（1987)在豚鼠背根神經(jīng)節(jié) 細(xì)胞中證明SP、CGRP、CCK和強(qiáng)啡肽（Dynorphin，DYN)四種神經(jīng)肽的共存。對于神經(jīng)遞質(zhì)共存的亞細(xì)胞部位，Hokfelt曾對肽和胺的共存提出了一種假說，即：①它們可分別貯存于同一神經(jīng)終末內(nèi)的不同形態(tài)的突觸小泡內(nèi)；②共存于大顆粒囊泡和小顆粒囊泡內(nèi)；③僅共存于小顆粒囊泡中；④僅共存于大顆粒囊泡內(nèi)；此假說尚待進(jìn)一步證實。Fried 的實驗結(jié)果表明，在大鼠輸精管，胺和肽的共存僅發(fā)生于大顆粒囊泡內(nèi)，Andrzejloesch 和Burnstock實驗證明在豚鼠腸道肌間神經(jīng)叢內(nèi)VIP和ACh共存于SAV小囊泡內(nèi)。應(yīng)用膠體金免疫電鏡技術(shù)，以不同直徑的金粒標(biāo)記不同的抗原，是研究遞質(zhì)共存的超微結(jié)構(gòu)定位較為理想的手段。
關(guān)于遞質(zhì)共存的生理意義，目前還不十分清楚，有作者設(shè)想與經(jīng)典遞質(zhì)共存的肽類可作為輔遞質(zhì)，在神經(jīng)細(xì)胞釋放時，對突觸后膜上主遞質(zhì)的受體起調(diào)制作用，從而調(diào)制信息傳遞。Hokfelt（1980)提出兩種遞質(zhì)共存的生理意義有以下五種可能性：①兩種遞質(zhì)可穿過突觸間隙作用于突觸后細(xì)胞，作用于相同或不同的受體；②一種物質(zhì)激活突觸后細(xì)胞的受體，另一種物質(zhì)則封閉另一種類型的受體，如在5—HT和SP共存的情況下，5—HT直接抑制突觸后細(xì)胞，SP封閉其它末梢釋放的ACh對突觸后的細(xì)胞的興奮作用；③一種物質(zhì)作用于突觸后細(xì)胞，第二種物質(zhì)則作用于突觸前末梢的自身受體（autoreceptor)，從而調(diào)制細(xì)胞終末對神經(jīng)遞質(zhì)的釋放；④一種物質(zhì)作用于突觸后細(xì)胞，第二種物質(zhì)則作用于其它末梢上的突觸前受體；⑤一種物質(zhì)作用于一類細(xì)胞，另一種物質(zhì)作用于另一種細(xì)胞，在這方面典型的例子是汗腺，汗腺的交感神經(jīng)元內(nèi)含有VIP和ACh，前者作用于周圍小血管，增加血流量；后者作用于腺體，刺激汗腺分泌。
總之，遞質(zhì)共存的研究是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域中一個嶄新的課題，它的研究對進(jìn)一步了解復(fù)雜的神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能有重要意義，而在這項課題的研究中，免疫細(xì)胞化學(xué)（包括光鏡和電鏡)無疑是一項有力的工具。
神經(jīng)系統(tǒng)是一個歷史發(fā)展的產(chǎn)物，有種族發(fā)育和個體發(fā)育的歷史。在種系發(fā)生方面，有不同的發(fā)育規(guī)律，如一些神經(jīng)肽自腔腸動物已經(jīng)發(fā)生，而VIP自魚類才開始發(fā)生。免疫反應(yīng)的強(qiáng)弱和神經(jīng)肽的含量亦因種屬不同而異，如筆者對輸精管的神經(jīng)支配的研究表明，在大鼠、豚鼠和貓等動物，輸精管管壁內(nèi)有豐富的神經(jīng)分布，而在人輸精管神經(jīng)分布異常稀疏。研究神經(jīng)肽的發(fā)生可以幫助了解肽類的發(fā)生規(guī)律，有利于選擇和建立實驗動物模型。個體發(fā)育，不但指胚胎發(fā)育，也指動物出生后發(fā)育以至衰老的規(guī)律，神經(jīng)系統(tǒng)的任何一個部分都可以從發(fā)育的角度去研究。在腸道，Epstein等在雞小腸壁內(nèi)神經(jīng)叢的研究表明，在雞胚發(fā)育的第7日出現(xiàn)膽堿能神經(jīng)成分，5～7天出現(xiàn)5—Ht 神經(jīng)細(xì)胞，NA神經(jīng)終末出現(xiàn)于第12～16日，神經(jīng)肽出現(xiàn)在這些遞質(zhì)之后。在小鼠、豚鼠和兔小腸壁內(nèi)神經(jīng)從發(fā)育規(guī)律的研究報告和雞相似。神經(jīng)肽的出現(xiàn)較晚，而神經(jīng)對肌肉發(fā)育的作用更晚，如在豚鼠小腸，雖然在胚胎第25日出現(xiàn)了膽堿能神經(jīng)細(xì)胞，但肌肉對神經(jīng)的反應(yīng)性出現(xiàn)在胚胎的第48日。各種神經(jīng)肽的含量和含肽類神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)目都隨發(fā)育、成長、衰老而產(chǎn)生規(guī)律性變化，如大鼠全腦或腦各分區(qū)中NSE的含量隨發(fā)育而增高，在第13天胚胎時NSE含量為50ng/mg蛋白質(zhì)，到成體（第40日)時為11000ng/mg蛋白質(zhì)，而定位于神經(jīng)膠質(zhì)的非神經(jīng)無烯醇酶（No-neuronal enolase, NNE)，在第11日的胚胎為8500ng/mg蛋白質(zhì)，出生后下降至5000ng/mg蛋白質(zhì)，到成體（第60日)時為11000ng/mg蛋白質(zhì)。以上結(jié)果表明，隨著神經(jīng)細(xì)胞的產(chǎn)生，NSE增加，而NSE/NNE比例顯著增高，說明在大鼠腦神經(jīng)元的分化過程中可能存在著由NNE轉(zhuǎn)變?yōu)镹SE的生物化學(xué)分子變化。楊恬、蔡文琴等（1994)報告了六種肽能神經(jīng)在人胚胎期的發(fā)育規(guī)律，AChE神經(jīng)出現(xiàn)最早，其它肽能神經(jīng)出現(xiàn)時間不一，分別在第11～16周。同一個體不同器官肽能神經(jīng)并非同時發(fā)生，如膀胱肽能神經(jīng)出現(xiàn)較小腸為晚。總之，神經(jīng)系統(tǒng)種族發(fā)育和個體發(fā)育這個領(lǐng)域的研究還有待于進(jìn)一步發(fā)掘。
神經(jīng)組織培養(yǎng)是從機(jī)體中取出組織或細(xì)胞，在模擬機(jī)體內(nèi)生理條件下進(jìn)行體外培養(yǎng)。免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)可用于培養(yǎng)的單個細(xì)胞或組織片染色，單個細(xì)胞可直接固定或冰凍后進(jìn)行免疫染色，而組織片在固定或冰凍后常需進(jìn)行切片后染色。由于體外神經(jīng)組織培養(yǎng)技術(shù)能使復(fù)雜的神經(jīng)系統(tǒng)簡單化，換而言之，能在神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能的研究方面提供一個簡單的模型，近年來，隨著培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展和與其它科學(xué)的相互結(jié)合，在神經(jīng)生物學(xué)這一研究領(lǐng)域中提供了不少的新資料，如利用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)可對原代分離培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞的特異抗原標(biāo)記（可以是細(xì)胞表面或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)成分)，從而區(qū)別其細(xì)胞類型，如用GFAP標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞、半乳糖腦苷脂、髓磷脂堿基蛋白（myelin basic protein, MBP)標(biāo)記少突膠質(zhì)細(xì)胞、NSE標(biāo)記神經(jīng)細(xì)胞、Ran-α標(biāo)記膠質(zhì)細(xì)胞表面的抗原等，這些特異的標(biāo)記在神經(jīng)生物學(xué)和臨床科研中有很大潛能，細(xì)胞表面標(biāo)記能夠區(qū)別活細(xì)胞，精確地研究細(xì)胞間特性和相互作用，細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記能有助于對神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能及相互作用的研究。Mirsky及其同事們利用半乳糖腦苷脂（GC)、硫脂（Sulphatide, S)和MBP對培養(yǎng)的雪旺氏神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的研究表明，雪旺氏神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在與其所依附的軸突分離后不超過5～6天，GC、S和MBP的免疫染色均為陰性，表明雪旺氏細(xì)胞需要持續(xù)性地從相應(yīng)的軸索獲得信息(Signal)才能制造出可為免疫染色所檢測出的髓鞘特異性糖脂和蛋白，而少突膠質(zhì)細(xì)胞則否，在沒有神經(jīng)細(xì)胞存在的情況下培養(yǎng)數(shù)周，仍保持GC、S和MBP免疫反應(yīng)陽性。本實驗結(jié)果成功地證明少突膠質(zhì)細(xì)胞和雪旺氏神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生髓鞘的方式是不同的。Abney等利用培養(yǎng)的胚胎和新生大鼠的腦細(xì)胞混懸液進(jìn)行特異性免疫標(biāo)記染色，證實了不同類型細(xì)胞在腦內(nèi)的發(fā)育順序：破傷風(fēng)毒素陽性神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)在第10天的胚鼠腦（測試的最早時間)，GFAP陽性星狀膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)在15～16天的胚腦，而GC陽性少突膠質(zhì)細(xì)胞直至出生后2～3天方才出現(xiàn)。利用18天胚鼠的小腸壁內(nèi)神經(jīng)叢培養(yǎng)后進(jìn)行各種神經(jīng)肽的免疫染色，Schultzberg等發(fā)現(xiàn)在這時的小腸壁內(nèi)神經(jīng)叢已具有內(nèi)源性的VIP、SP、ENK和SOM免疫反應(yīng)性神經(jīng)元。
由于免疫細(xì)胞化學(xué)所應(yīng)用的各種標(biāo)記物如鐵蛋白、膠體金和熒光素等都能無例外地與配體（即與受體呈特異結(jié)合的物質(zhì))相結(jié)合，因此可應(yīng)用于細(xì)胞表面（包括神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞)表面受體的定位。Philips和Bennet（1987)應(yīng)用抗肌球蛋白和熒光素標(biāo)記的α-眼鏡蛇毒素成功地顯示了乙酰膽堿受體（Acetycholine receptor clusters)在鳥肌上的發(fā)育規(guī)律。近年來，應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)進(jìn)行受體再循環(huán)的免疫電鏡觀察，取得了令人矚目的進(jìn)展。Geueze利用膠體金-蛋白A-抗唾液酸糖蛋白的受體抗體在免疫電鏡下觀察證明，配體與細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合后，由受體介導(dǎo)入腸作用而進(jìn)入胞內(nèi)，在入胞早期，唾液腺糖蛋白及其受體均存在于有覆衣囊泡中，并與囊泡內(nèi)表面密切結(jié)合。在人胞囊泡內(nèi)，則見配體游離于囊泡腔中，內(nèi)移的受體可再循環(huán)回細(xì)胞表面加以利用。本實驗結(jié)果為細(xì)胞膜受體的再循環(huán)提供了有力的證據(jù)。
免疫細(xì)胞化學(xué)在神經(jīng)科學(xué)的應(yīng)用已由單純的形態(tài)學(xué)研究逐步向與機(jī)能研究、應(yīng)用研究和臨床實踐相結(jié)合。如研究腦啡肽與鎮(zhèn)痛的關(guān)系，SP與轉(zhuǎn)導(dǎo)傷害性刺激的關(guān)系以及在各種生理和病理條件下神經(jīng)肽的變化與病理生理作用機(jī)制的關(guān)系等。在研究方法上也不斷改進(jìn)，如免疫組化的定量研究由簡單的積分法逐步走向與放射免疫測定相結(jié)合、與圖像分析相結(jié)合，測定單位面積內(nèi)和/或每個神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)免疫反應(yīng)物含量的變化。
