在腎臟疾病時，免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)主要應(yīng)用于腎臟穿刺組織的檢查，也可應(yīng)用于血清或腎臟洗脫液及尿液的特殊檢查，茲分述如下：
腎穿刺組織一般應(yīng)切割為三小塊，分別作冰凍切片、石蠟切片及超薄切片，進(jìn)行熒光顯微鏡、光學(xué)顯微鏡及透射電鏡觀察。所應(yīng)用的免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)包括免疫熒光、免疫酶標(biāo)及免疫電鏡，茲分述如下：
（一)免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的應(yīng)用
自1938年超高壓汞燈熒光顯微鏡問世后，Coon于1942年首先應(yīng)用熒光素標(biāo)記抗體檢查肺炎球菌，為熒光抗體技術(shù)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。1961年Dixon開始在腎臟疾病中應(yīng)用，對腎臟的免疫病理研究起了重要的推動應(yīng)用，并逐漸成為在腎臟疾病的病理診斷中不可缺少的重要環(huán)節(jié) 。主要用于冰凍切片，具體操作技術(shù)如下：
1．切片及染色腎組織要求為未經(jīng)任何處理的新鮮組織，應(yīng)立即送入恒溫冷凍切片機(jī)（cryostat)內(nèi)，將腎組織放置于金屬托上，周圍添加OCt compound 包埋劑（如無包埋劑，滴加數(shù)滴生理鹽水亦可)，迅速冷凍至-20℃，切出3~5μm厚的冰凍切片附貼于載玻片上，至少需切10張以上備用。繼而使用熒光素標(biāo)記之各種抗體進(jìn)行免疫熒光染色（具體操作步驟參見第三章 )。所使用之熒光標(biāo)記抗體包括羊或兔抗人各種免疫球蛋白(IgG、IgA、IgM、IgE、IgD)、抗人補(bǔ)體各種成分（C1q、C4、C2、C3、C5、備用素、B因子等)以及抗人纖維蛋白元等，以期了解腎小球內(nèi)有何種免疫球蛋白沉積、補(bǔ)體激活的途徑和有無凝血機(jī)制啟動。此外，目前尚有應(yīng)用熒光標(biāo)記之抗纖維連接蛋白（fibronectin)、抗層粘連蛋白（laminin)、抗α-纖溶酶抑制因子（α-PI)、抗纖溶酶原（P1q)等特殊抗體，以探討研究各種腎小球腎炎時腎小球內(nèi)纖維連接蛋白和層粘連蛋白分布情況的變化以及凝血和纖溶系統(tǒng)成分的變化。常使用之熒光素為異硫氰酸熒光素（FITC，顯綠色熒光)及異硫氰四乙基羅達(dá)明（Rodamine B-200，顯橙紅色熒光)，對各種抗體進(jìn)行標(biāo)記。必須指出，每種熒光抗體只能檢測一種相應(yīng)抗原，因此必須準(zhǔn)備多張冰凍切片，才能滿足檢查要求。一般在檢查每一種抗原時，只能使一種相應(yīng)抗體用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。如果同時需要檢查二種抗原時，可同時使用FITC及RB-200標(biāo)記的不同抗體進(jìn)行雙標(biāo)記法觀察。
2．熒光顯微鏡觀察一般要求使用質(zhì)量較高的熒光顯微鏡，最好使用落射光型，以提高在高倍鏡觀察時之清晰度，并應(yīng)配備電子攝影裝置，以便及時進(jìn)行記錄。進(jìn)行熒光顯微鏡觀察時，濾光片之配合使用十分重要。以常用之日本olympus熒光顯微鏡為例，觀察FITC標(biāo)記之抗體時，激發(fā)濾光片須使用RG-12，而壓制濾光片應(yīng)使用O-350，如觀察RB-200標(biāo)記之抗體時，激發(fā)濾光片須使用UG-1，而壓制濾光片應(yīng)使用R-610。觀察時應(yīng)做以下記錄：①使用抗體的種類。②熒光顯示的部位：如顯示于腎小球毛細(xì)血管壁、系膜區(qū)、腎球囊壁、腎小管基底膜、間質(zhì)血管壁及間質(zhì)細(xì)胞等。③熒光顯示的型式、：為連續(xù)線形、不連續(xù)顆粒狀、團(tuán)塊狀或短線狀，不規(guī)則狀等。④熒光顯示的強(qiáng)度：可分為（—)熒光弱、（±)為熒光微弱、（+)為明確可見熒光、（++)為明亮熒光、（+++)為耀眼熒光。在特殊情況下可進(jìn)行雙重標(biāo)記，即分別使用FITC標(biāo)記和RB-200標(biāo)記的兩種不同抗體，在同一切片上進(jìn)行染色，使用不同濾光片進(jìn)行觀察及攝影，以綠色熒光和橙紅色熒光在同一張切片上顯示兩種抗原分布的部位。
3．熒光顯微鏡攝影技術(shù)使用熒光顯微鏡觀察時，由于光源紫外線的照射，切片標(biāo)本上抗原的熒光亮度常很快逐漸減弱，并可發(fā)生熒光淬滅現(xiàn)象；且免疫熒光染色的切片不能長期保存，因此必須立即及時進(jìn)行顯微攝影以記錄所觀察到的情況，以作為診斷根據(jù)和作為資料保存。攝影時一般應(yīng)使用感光速度較快的彩色膠片，以160或400ASA為宜，才能保證拍攝出良好的熒光圖像。必須指出的是，在標(biāo)本的熒光強(qiáng)度不太明亮?xí)r，使用自動曝光攝影設(shè)備常不能取得良好的攝影效果。由于在攝影過程中，熒光強(qiáng)度逐漸減弱，照像機(jī)快門常長期不能關(guān)閉，以致影響攝影效果。因此，各個實(shí)驗室應(yīng)根據(jù)所使用的熒光顯微鏡的具體情況，以手動控制自動摸索適宜的攝影條件。一般應(yīng)首先使用黑白膠片在低倍鏡及高倍鏡下對中等熒光亮度的標(biāo)本以不同曝光時間進(jìn)行攝影，根據(jù)底片曝光效果找出合適的曝光時間。待積累一定經(jīng)驗后再使用彩色膠片進(jìn)行攝影。根據(jù)個人的經(jīng)驗，以O(shè)lympus落射光型熒光顯微鏡為例，中等熒光亮度的標(biāo)本，使用160ASA彩色膠片，于低倍鏡下攝影，曝光時間為1~2min即可，高倍鏡下攝影時曝光時間需延長1倍。曝光時間適宜之彩色膠片，洗印后熒光呈綠色；如呈現(xiàn)黃色，即為曝光過度，應(yīng)減少曝光時間。一般在熒光顯微鏡攝影時，最好應(yīng)準(zhǔn)備3個照像機(jī)暗盒，分別拍攝彩色正片（作幻燈片用)、彩色負(fù)片（作實(shí)驗記錄用)及黑白負(fù)片（供發(fā)表文章 用)，以保存完整之資料。
必須指出，腎組織冰凍切片的免疫熒光染色法特異性強(qiáng)、敏感度高，對熒光標(biāo)記物的分布部位、分布型式擴(kuò)熒光強(qiáng)度顯示極為明確。可在組織及細(xì)胞水平進(jìn)行定位觀察，為國際上公認(rèn)的較好觀察方法。但因其需要恒溫冷凍切片機(jī)、熒光顯微鏡等昂貴設(shè)備，且切片不能長期保存為其不足之處。
如未能及時制作冰凍切片，亦中使用石蠟切片進(jìn)行熒光染色。石虹節(jié) 片需經(jīng)二甲苯脫蠟，降酒精至水，用0.1%胰蛋白酶在37℃溫箱內(nèi)消化20min，以暴露其抗原決定簇。再用各種熒光標(biāo)記抗體按常規(guī)步驟進(jìn)行染色后，熒光gydjdsj.org.cn/rencai/顯微鏡觀察。石蠟切片之熒光觀察效果不佳，其結(jié)果僅可作為參考。
（二)免疫酶標(biāo)細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的應(yīng)用
由于免疫熒光技術(shù)的應(yīng)用受一定的條件限制，1966年Nakane 使用辣 根過氧化物酶（HRP)代替熒光素對抗體進(jìn)行標(biāo)記，通過酶的顯示使抗原定位，稱為酶標(biāo)記抗體技術(shù)。其后，1969年Mason,1970年Sternberger又在基礎(chǔ)上發(fā)展了非標(biāo)記酶抗體法。包括酶橋法和過氧化物酶-抗過氧化物酶復(fù)合物法（PAP)。這一技術(shù)的建立，為醫(yī)學(xué)、生物學(xué)的各個領(lǐng)域提供了一個很好的研究手段，在免疫學(xué)和免疫病理學(xué)的研究和診斷工作中已日益廣泛應(yīng)用。
1．免疫酶標(biāo)技術(shù)及其進(jìn)一步發(fā)展 免疫酶標(biāo)細(xì)胞化學(xué)技術(shù)較免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)有不少優(yōu)點(diǎn)。首先，酶標(biāo)法染色之切片使用普通的光學(xué)顯微鏡即可觀察，切片可以長期保存；用蘇木素進(jìn)行細(xì)胞核的重復(fù)染色后，還能對組織結(jié)構(gòu)和抗原進(jìn)行細(xì)致確切的觀察和定位。PAP法的特異性和敏感性皆優(yōu)于熒光抗體法，且操作簡便，適合于一般實(shí)驗室應(yīng)用（詳見第四章 )。
免疫酶標(biāo)技術(shù)以明確的顏色（棕褐色或鮮紅色)顯示抗原沉積的形式（細(xì)線狀、顆粒狀或團(tuán)塊狀)，又可精確地定位，不但可以判斷抗原沉積于腎小球毛細(xì)血管壁或系膜區(qū)，也可辨別出抗原在毛細(xì)基血管基底膜內(nèi)外側(cè)的沉積部位。故免疫酶標(biāo)法在此方面的優(yōu)于免疫熒光法，但其反應(yīng)強(qiáng)度受力人為因素干擾較大（如作用時間的長短、抗體濃度的差別等)，且有時背景出現(xiàn)非特異性染色，而影響對結(jié)果的判斷。如果組織內(nèi)源酶未消除干凈，亦可出現(xiàn)假陽性結(jié)果。
近年來，由于單克隆抗體的制備成功和應(yīng)用，推動了免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展。單克隆抗體是通過細(xì)胞融合技術(shù)，建立雜交瘤細(xì)胞株而產(chǎn)生的高純度抗體。由于免除了抗原種或株間的交叉反應(yīng)，因而提高了抗原抗體反應(yīng)的特異性和敏感性。在腎臟疾病的研究中，主要用于肝炎病毒抗原的檢測，如使用抗HBsAg或抗HBeAg單克隆抗體，用ABC法檢測腎小球中肝炎病毒抗原的存在部位和數(shù)量等。
目前，由于分子生物學(xué)的進(jìn)展，原位核酸分子雜交技術(shù)已與免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)相結(jié)合，而成為分子雜交免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)（詳見第二十章 )。這一技術(shù)在病理學(xué)上的應(yīng)用可以從核酸及其功能活動水平上，在細(xì)胞或組織的原位顯示有助于診斷或研究的信息。目前常使用乙型肝炎病毒（HBV)的DNA標(biāo)記后作為探針，研究乙肝病毒相關(guān)性腎炎腎組織中HBV-DNA之存在狀態(tài)。
2．光學(xué)顯微鏡觀察及攝影技術(shù)由于免疫酶標(biāo)技術(shù)的應(yīng)用，使用光學(xué)顯微鏡可對腎組織內(nèi)沉積的抗原性物質(zhì)（包括免疫復(fù)合物)進(jìn)行定性、定位及定量觀察。例如腎小球內(nèi)沉積的IgG、IgA、IgM等免疫球蛋白C1q、C3等補(bǔ)體成分以及纖維連接。蛋白（fibronectin)和HBV病毒抗原等的存在部位、分布形式和狀況及量的多少，并結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察，研究其與形態(tài)學(xué)變化之間的關(guān)系。觀察時常需使用油鏡。觀察結(jié)果需進(jìn)行攝影記錄。攝影時應(yīng)使用研究用顯微鏡附有攝影設(shè)備及自動曝光裝置。攝影技術(shù)在具備自動曝光設(shè)備條件下簡便易行，但濾光片之選擇甚為重要。在拍攝彩色反轉(zhuǎn)片（制作幻燈片時)時，應(yīng)使用燈光型彩色反轉(zhuǎn)片，濾光片無需使用，直接用鎢絲燈泡之黃光即可進(jìn)行攝影。如使用普通之日光型彩色反轉(zhuǎn)片時 ，則需使用藍(lán)色濾光片。在拍攝彩色負(fù)片（制作彩色照片用時)，由于皆為日光型膠片，故需使用藍(lán)色濾光片。拍攝彩色膠片時，首先需注意膠卷之感光度，應(yīng)將自動曝光裝置調(diào)至相應(yīng)位置；另需在拍攝每張膠片前皆需調(diào)節(jié) 色溫，以保證獲得良好的彩色效果。在拍攝黑白膠片（供發(fā)表論文用)時，應(yīng)使用綠色濾光片，以加強(qiáng)反差，提高攝影效果。
（三)電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的應(yīng)用
免疫電鏡在細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)水平應(yīng)用抗原與相應(yīng)抗體能特異性結(jié)合的原理，使用標(biāo)記抗體對細(xì)胞內(nèi)存在的抗原性物質(zhì)進(jìn)行定性、定位和定量觀察，是免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)在亞細(xì)胞水平的進(jìn)一步發(fā)展。
1．免疫電鏡標(biāo)本制備腎臟組織的免疫電鏡標(biāo)本制備與一般透射電鏡標(biāo)本的制備有所不同，其具體步驟如下：
（1)固定與包埋：腎臟組織一般采用低濃度戊二醛為固定劑，而不使用鋨酸，以盡可能多地保存抗原活性，常使用甲醛-戊二醛固定液（甲醛4%，戊二醛0.05%~0.5%)。包埋劑常使用 Lowicryl K4M（丙烯酸酯類化合物)或LRWhite 樹脂在-20~35℃低溫下包埋，以紫外線照射使之聚合。避免使用常規(guī)之環(huán)氧樹脂包埋，因環(huán)氧樹脂需加熱使之聚合，而使標(biāo)本之抗原活性下降。
（2)修塊、定位及切片：包埋后之組織塊經(jīng)初步修塊后，先在超薄切片機(jī)上用玻璃刀（勿用鉆石刀)切出一張0.5~1μm厚的半薄片，用1%鹼性復(fù)紅或美藍(lán)溶液進(jìn)行染色，在光鏡下觀察組織內(nèi)腎小球的數(shù)量及病變情況，挑選出一個病變最為典型的腎小球，作出標(biāo)記。然后在組織塊上定出相應(yīng)部位，用刀切去周圍組織，修成約0.1mm大小之組織塊，再用超薄切片機(jī)切出500 。A厚度的超薄切片。
（3)免疫標(biāo)記：目前應(yīng)用最多的是膠體金標(biāo)記抗體（詳見第七章 )。
2．免疫電鏡觀察腎組織標(biāo)本皆采用包埋后染色，第一抗體為特異性抗血清（如兔抗人IgG)，第二抗體為膠體金標(biāo)記之抗體（如豬抗兔IgG，金標(biāo)記Au10)。最后用枸椽酸鉛（或醋酸鉛)作對照染色，在透射電鏡下觀察。根據(jù)金顆粒的分布狀況，可作定位、定性及定量觀察，了解腎小球超微結(jié)構(gòu)成分的變化、探討腎臟疾病的病原及研究免疫復(fù)合物（沉積之電子致密物質(zhì))的組gydjdsj.org.cn/zhuyuan/成成分等（詳見后)。
腎臟疾病時，血清學(xué)檢查亦甚為重要，現(xiàn)僅就與免疫細(xì)胞化學(xué)有關(guān)者介紹如下：
1．血清或腎臟洗脫液內(nèi)抗腎小球基底膜抗體的測定在快速進(jìn)行性腎小球腎炎（RPGN)及Goodpasture綜合征病人血清中常存在有抗腎小球基底膜抗體，對病人血清進(jìn)行檢查有重要的診斷意義。動物實(shí)驗中，對馬杉氏腎炎等實(shí)驗性腎小球腎炎動物，進(jìn)行腎臟洗脫液的檢查，以確定有無抗腎小球基底膜抗體的存在。一般常用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)進(jìn)行檢查，先將病人血清與靈長類（如猴等)的腎組織冰凍切片在37℃濕盒內(nèi)孵育半小時，再將切片用FITC熒光素或HRP標(biāo)記的抗人Igg 抗體處理。如果病人血清中存在有抗腎小球基底膜抗體，即可與切片上的腎小球基底膜相結(jié)合，進(jìn)一步與熒光標(biāo)記抗人IgG抗體相反應(yīng)，而顯示沿腎小球毛細(xì)血管壁呈連續(xù)線形之熒光分布（酶標(biāo)抗體亦顯示同樣之連續(xù)線形分布)。本方法又可用于與抗腎小管基底膜抗體和抗核抗體的鑒別。
2．血清中循環(huán)免疫復(fù)合物內(nèi)IgG亞類的分析以3%聚乙二醇（PEG)沉淀病人血清中大分子蛋白質(zhì)，分別使用鼠抗人IgG亞類IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的單克隆抗體，以ELISA法測定免疫復(fù)合物內(nèi)IgG亞類的分布狀況。以同樣方法亦可測定腎小球中沉積的免疫復(fù)合物內(nèi)的IgG亞類。Noel 報道，不同腎炎時腎小球內(nèi)沉積之IgG亞類有所不同。原發(fā)性膜性腎炎之沉積物為Igg 1和IgG4，狼瘡性腎炎之沉積物為IgG1、IgG2和IgG3。
3．血清中Tamm-Horsfall糖蛋白（THP)的測定 THP是由腎小管髓袢升支厚壁段及遠(yuǎn)曲小管上皮細(xì)胞合成的糖蛋白，主要存在于正常人的尿中，血清中含有微量。當(dāng)腎功能減退時，血及尿中THP明顯降低，尿毒癥時則血及尿中幾乎測不出THP。目前可使用抗THP單克隆抗體，用ELISA夾心法測定血清中THP的含量。第一抗體使用鼠抗人THP單克隆抗體，第二抗體為HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG。
4．其它血清中自身抗體如抗核抗體、抗雙鏈DNA抗體、抗Sm抗體等的測定，對狼瘡性腎炎有診斷意義。抗著絲點(diǎn)抗體的測定對進(jìn)行性系統(tǒng)性硬化（硬皮病)有診斷意義，以上測定皆使用免疫熒光法，具體操作不再贅述。
1．尿中THP測定如前所述，使用抗THP單克隆抗體進(jìn)行測定。除在慢性腎功能損害時血中及尿中THP下降以外，目前提出當(dāng)腎移植急性排斥反應(yīng)時或毒性物質(zhì)導(dǎo)致腎小管大量破壞時，尿中可出現(xiàn)THP升高。
2．尿中抗體包裹細(xì)菌的測定尿路感染可分為上尿路感染（腎盂腎炎)和下尿路感染（膀胱炎、尿道炎及前列腺炎)。上尿路感染時，細(xì)菌來源于腎組織，機(jī)體對細(xì)菌產(chǎn)生抗體而包裹于細(xì)菌表面，形成抗體包裹細(xì)菌（ACB)�？贵w為IgG、IgA或IgM組成，可用熒光素標(biāo)記的抗人lgG、lgA、或lgM與之結(jié)合而使其顯示熒光。反之，下尿路感染之細(xì)菌，一般不能形成抗體包裹細(xì)菌，用免疫熒光檢查常為陰性，故能對上下尿路感染進(jìn)行鑒別診斷。
3．尿沉渣中管型及粘液絲中免疫球蛋白之測定使用直接熒光進(jìn)行觀察，腎小球腎炎病人尿沉渣中管型及粘液絲可觀察到IgG、IgA或IgM。一般認(rèn)為是由于病變腎小球漏出之免疫球蛋白，與腎小球內(nèi)沉積之免疫球蛋白可能無關(guān)。但泌尿系感染時尿中粘液絲中很少檢出免疫球蛋白。故本檢查有助于腎小球腎炎與泌尿系感染的鑒別。
腎小球的固有細(xì)胞有3種，即系膜細(xì)胞、臟層上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞。近年來隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，腎小球的體外培養(yǎng)亦受到了重視。1969年Bernik首先在體外培養(yǎng)腎小球成功，并初步培養(yǎng)出系膜細(xì)胞，1975年Fish 正式分離培養(yǎng)系膜細(xì)胞獲得成功，1978年Kreisberg分離培養(yǎng)上皮細(xì)胞成功，1984年Striker分離培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞成功。目前，國內(nèi)亦有不少單位從事腎小球細(xì)胞體外培養(yǎng)工作，已取得一定成績。腎小球細(xì)胞的體外培養(yǎng)，不僅限于正常人及兔、鼠等動物，目前亦發(fā)展至腎臟病人腎穿刺組織進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。經(jīng)體外培養(yǎng)的一生長之原代培養(yǎng)細(xì)胞需進(jìn)行鑒定，除使用光學(xué)顯微鏡及電子顯微鏡觀察其形態(tài)及結(jié)構(gòu)外，尚需進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色而使用一系列免疫酶標(biāo)記的相應(yīng)抗體。例如使用抗結(jié)蛋白（desmin)單克隆抗體和抗肌動蛋白（actin)單克隆抗體（ABC試劑盒)，對上皮細(xì)胞進(jìn)行鑒定，二者皆為強(qiáng)陽性。使用抗細(xì)胞角蛋白（cytokerfatin)單克隆抗體（ABC試劑盒)，對上皮細(xì)胞進(jìn)行鑒定，以鹼性磷酸酶為底色，上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)可見紅色顆粒。內(nèi)皮細(xì)胞之鑒定則使用抗Ⅷ因子單克隆抗體（因第Ⅷ因子只在內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)生成)。
此外，目前已認(rèn)識到天很多生物活性因子如白細(xì)胞介素-1及6、血小板源性生長因子（PDGF)、轉(zhuǎn)化生長因子（TGFβ)、內(nèi)皮素等皆可對系膜細(xì)胞、上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞起作用。使用其合成及分泌多種細(xì)胞因子如血小板活化因子、前列腺素E2、白細(xì)胞介素-1、6、8等。人們可應(yīng)用分子雜交免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)，探知系膜細(xì)胞、上皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞中相應(yīng)細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)，從而了解在不同腎小球疾病中各種細(xì)胞功能的變化。對腎小球體外培養(yǎng)細(xì)胞的分子生物學(xué)研究，開拓了研究腎小球疾病機(jī)制的廣闊領(lǐng)域。
