實用免疫細胞與核酸:第二節(jié)　DNA的變性與復性

一、DNA變性

DNA變性是指雙螺旋之間氫鍵斷裂，雙螺旋解開，形成單鏈無規(guī)則線團，因而發(fā)生性質改變（如粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外吸收增加等)，稱為DNA變性。加熱、改變DNA溶液的pH、或受有機溶劑（如乙醇、尿素、甲酰胺及丙酰胺等)等理化因素的影響，均可使DNA變性。

通常，可利用DNA變性后波長260nm處紫外吸收的變化追蹤變性過程。因為DNA在260nm處有最大吸收值這一特征是由于含有堿基組成的緣故，在DNA雙螺旋結構模型中堿基藏于內側，變性時由于雙螺旋解開，于是堿基外露，260nm紫外吸收值因而增加，這一現象稱為增色效應（hyperchromic effect)。見圖18-2。

圖18-2 DNA的增色反應

如果升高溫度使DNA變性，以溫度對紫外吸收作圖，可得到一條曲線，稱為溶解曲線（見圖18-3)，由圖可見當溫度升高到一定范圍時，DNA溶液在260nm處的吸光度突然明顯上升至最高值，隨后即使溫度繼續(xù)升高，其吸光度也無明顯變化。由此說明DNA變性是在一個很窄的溫度范圍內發(fā)生，增色效應是爆發(fā)式的。從而也說明當達到一定溫度時，DNA雙螺旋幾乎是同時解開的。通常人們把50%DNA分子發(fā)生變性的溫度稱為變性溫度（即熔解曲線中點對應的溫度)，由于這一現象和結晶的融解相類似，故又稱融點或融解溫度（melting temperature, Tm)。因此Tm是指消光值上升到最大消光值一半時的溫度。

圖18-3 DNA的Tm值

綜上所述，Tm值和增色效應是目前描述DNA特性所常用的兩個量。假定一個DNA大分子最初全部是雙螺旋結構，在熱變性后消光系數上升30%以上；如果DNA原先局部就處于單鏈狀態(tài)（例如在分子末端)，則變性后上升較少。增色效應的大小是DNA性質的一個簡單指標，與分子量無關。Tm不是一個固定的數值，它與很多因素有關：pH、離子強度和DNA的堿基比例。隨著溶劑內離子強度上升，Tm值也隨著增大。在某一離子強度（～10^-3M)以下，無需加熱就使溶于其中的DNA出現不可逆變性。與A-T堿基配對比較，DNA雙螺旋內的G-C配對更為牢固。在相同條件下，DNA內G-C配對含量高，其Tm值也高。

假定在一個雙鏈DNA分子內某些片段含有較多G-C堿基對，根據它們局部Tm值差，用電子顯微鏡就可以觀察和測量到這些片段，如在DNA某一片段內含有較多的A-T堿基對，在某一個溫度時就可能出現雙鏈解離的現象。但在同一溫度下，含G-C對較多部分仍然保持雙鏈結構。這是一種非常有用的技術。

DNA的Tm值與以下因素有關：

（1)DNA的均一性：均一DNA如病毒DNA，解鏈發(fā)生在很窄的范圍內，而不均一的DNA如動物細胞NDA其Tm值的范圍則較寬。

（2)DNA分子中（G+C)的含量：一定條件下DNA的Tm值，由G+C含量所決定，因為G+C之間有3個氫鏈，因此G+C含量較高的DNA，Tm值較高，二者的關系可用以下經驗式表示：

%（G+C)=（Tm-63.0)×2.44

gydjdsj.org.cn/shouyi/實驗表明DNA分子中（G+C)gydjdsj.org.cn/yaoshi/克分子含量百分比的大小與Tm值的高低呈直線關系，見圖18-4。

圖18-4 DNA和Tm值與G-C含量的關系

（3)溶劑的性質：Tm不僅與DNA本身性質有關，而且與溶液的條件有關，通常溶液的離子強度較低時，Tm值較低，融點范圍也較寬，離子強度增高時，Tm值長高，融點范圍也變窄。因此，DNA制劑不應保存在離子強度過低的溶液中，一般保存在1mol/l NaCl溶液中較穩(wěn)定。

二、復性

變性DNA只要消除變性條件，二條互補鏈還可以重新結合，恢復原來的雙螺旋結構，這一過程稱為復性（renaturation)。通常DNA熱變性后，將溫度緩慢冷卻，并維持在比Tm低25～30℃左右時，變性后的單鏈DNA即可恢復雙螺旋結構，因此，這一過程又叫做退火。復性后的DNA，理化性質都能得到恢復。倘若DNA熱變后快速冷卻，則不能復性（圖18-5)。

圖18－5　熱變性過程和兩種冷卻過程示意圖

影響復性速度的因素很多，同樣條件下，DNA順序簡單的分子復性很快，如polyd[T]和polyd[A]由于彼此互補識別很快，故能迅速復性。但順序較復雜的DNA分子復性則較慢。因此通過變性速率的研究，可以了解DNA順序的復雜性。DNA片段的大小也影響變性的速率，因為DNA片段愈大，擴散速度愈低，使DNA片段線狀單鏈互相發(fā)現互補的機會減少。因此，在復性實驗中，有時將DNA切成小片段，再進行復性。同樣條件下，同一種DNA濃度愈高，復性速度也愈快。溶液的離子強度對復性速度也有影響，通常鹽濃度較高時，復性速度較快。

Doty研究小組是最早對DNA變性過程進行深入研究的。它們所獲得的結果表明，在達到Tm值時，兩條DNA單鏈分離開。如果在加熱之后慢慢地冷卻，則出現部分復性，即DNA的一部分回復到雙螺旋結構。復性的程度取決于DNA濃度及信息含量的多少。病毒DNA（信息含量少)比哺乳動物DNA容易復性，而DNA濃度較高時，有利于復性，快速冷卻使DNA仍然處于變性狀態(tài)，這時自由單鏈成鏈線團結構。對這種情況，人們稱之為螺旋-線團轉化過程（helix-coil-transition)�？焖倮鋮s時消光系數固然有所下降，但比天然DNA的數值始終要大。

細胞核DNA復性的動力學研究指出，DNA內很少片段有重復的或很相似的堿基順序（所謂重復DNA)。DNA復性的程度和過程與其信息含量的多少等有關；因而病毒DNA比細菌DNA復性得快。Britten發(fā)現一種測定和觀察復性過程的方法。X軸表示變性DNA原始濃度（Co)和保溫時間的乘積，縱軸表示DNA復性部分（重新作為雙螺旋結構出現)。DNA比例可以用羥基磷灰石柱的辦法加以確定，因為這種柱能夠使單鏈和雙鏈DNA分離開來。DNA復性曲線呈S形，隨著信息含量增加，此形狀相同曲線往往較高Co.t值處移動。奇怪的是，從細胞核來的DNA在復性時顯示出完全不同的情形：這些DNA中的一部分異常快地復性，而另一些DNA只有在極高的Co.t值時才出現預期的復性。對快速復性可以作這樣的解釋，即在某一DNA之內同時有幾個相同或很類似的順序存在，因而找重復順序比找DNA內唯一順序要快得多。后者含有特殊的遺傳信息，常被稱為獨特DNA。與之相反是重復DNA片段。

真核DNA自發(fā)復性的一種特殊途徑是通過發(fā)夾結構。對單鏈而言，要生成這種發(fā)夾結構，要求一種特定的堿基順序，這種順序稱作回文（正讀反讀都相同)結構。為了構成回文結構，DNA片段的堿基順序必須在互補鏈內找到相反的順序；在具有相反堿基順序的兩個DNA片段之間，顯然常常出現短的中間片段由于存在這樣的核苷酸順序，在復性時就能形成發(fā)夾結構。

如果存在很多重復回文結構，在部分復性時就能通過形成DNA側鏈而出現十字結構。DNA回文結構使DNA片段出現回旋對稱性。這種結構常常出現在DNA和蛋白質之間相互作用的地方，特別是后者起控制作用時。