近年，不少科技工作者將原位雜交組織細(xì)胞化學(xué)技術(shù)（ISHH)應(yīng)用于細(xì)胞分裂中期（Metaphase)和分裂間期（Interphase)的染色體鋪片上，利用標(biāo)記的核苷酸探針與之進行雜交，可在光鏡或電鏡水平檢測到不同的特異性的標(biāo)記物。目前，原位雜交組織化學(xué)在染色體鋪片的應(yīng)用主要在三個方面：染色體的基因分配或基因圖（Gene assignment)的研究、癌細(xì)胞或癌前組織的染色體異常的間期細(xì)胞遺傳學(xué)分析研究和性染色體對胚胎的生前診斷。在依次介紹這些方法的應(yīng)用以前，我們先簡要介紹一個有關(guān)染色體的基本的知識和染色體鋪片的制作方法。
體細(xì)胞的染色體是46個，23個，其中22對是常染色體，一對是性染色體。男性一對XY，女性為XX。染色體的形態(tài)隨著細(xì)胞周期的不同而有所改變，在光學(xué)顯微鏡下所看到的染色體是細(xì)胞分裂中期染色體（metaphase chromsome)。
每個染色體含有兩條染色單體，呈赤道狀彼此分離，只有著絲粒處相連。根據(jù)著絲粒的位置分為三種類型，中部著絲粒型，亞中部著絲粒和端著絲粒型（圖21-1)。
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圖21-1 正常人體細(xì)胞的三種染色體
1．中部著絲點染色體；2.近中部著絲點染色體；3.www.med126.com近端部著絲點染色體
1.非顯帶染色體特征分為七組
A組（1～3)：為最大的具中部著絲粒染色體，這組染色體相互間很易區(qū)別。第1號和第2號染色體大小相似，唯第2號染色體為近中部著絲粒染色法。第3號染色體較1、2號染色體小，為中部著絲粒染色體。
B組（4～5)：為大的具中部著絲粒染色體。2對染色體之間在形態(tài)和長度上較難區(qū)別。
C組（6～12號和X)：為中等大小的具中部或近中部著絲粒染色體。這組染色體較難區(qū)分，其中第6、7、11號和X染色體為中部著絲粒染色體，第8、9、10和12號染色體為近中部著絲粒染色體。女性為2個X染色體。男性只有1個X染色體。
D組（13～15號)：為www.gydjdsj.org.cn/Article/中等大小的具近端著絲粒染色體。在其短臂上有隨體。與他組染色體有明顯區(qū)別。但3對染色體之間較難區(qū)別。
E組（16～18號)：為小的具中部或近中部著絲粒染色體。第16號染色體為中部著絲粒染色體，第17號和18號染色體為近中部著絲粒染色體。不過，著絲粒位置第18號較第17號染色體更近端部。
F組（19～20號)：為更小的中部著絲粒染色體。2對染色體之間，形態(tài)上很難區(qū)別。
G組（21～22號和Y)：為最小的近端著絲粒染色體。第21號和22號染色體大小相似，且短臂上常連有隨體。Y染色體常比第21和22號染色體大、染色深。且無隨體。Y染色體長臂2個染色單體比較靠攏，長臂末端也較模糊。
2．G帶染色體的特征
第1號染色體：識別并不困難，但初學(xué)者易把長短臂顛倒。短臂的近側(cè)1/2處有2個深帶。遠(yuǎn)側(cè)有一半幾乎為淺染區(qū)；短臂共分3區(qū)。界標(biāo)為近側(cè)的深帶（2區(qū)1帶)和中段的深帶（3區(qū)1帶)。長臂近側(cè)為一窄的淺帶。中段和遠(yuǎn)側(cè)段各有2條深帶；長臂共分4區(qū)，界標(biāo)為次縊痕遠(yuǎn)側(cè)的淺帶（2區(qū)1帶)、中段的深帶（3區(qū)1帶)和遠(yuǎn)側(cè)的深帶（4區(qū)1帶)。
第2號染色體：短臂可見4條深帶。中段的2條深帶�；ハ嗫拷�，表現(xiàn)為1條深帶；短臂共分2區(qū)，界標(biāo)為1淺帶（2區(qū)1帶)。長臂可見4～7帶，近側(cè)著色甚淺，中段及遠(yuǎn)側(cè)著色較深；長臂共分3區(qū)，界標(biāo)為2個淺帶（2區(qū)1帶和3區(qū)1帶)。
第3號染色體：短臂近側(cè)可見2條深帶；遠(yuǎn)側(cè)可見3條深帶，其中遠(yuǎn)端的1條帶較窄，染色淺；短臂分為2區(qū)，界標(biāo)為1淺帶（2區(qū)1帶)，長臂近側(cè)和遠(yuǎn)側(cè)各有1條較寬的深帶：好的標(biāo)本近側(cè)深帶可分為2條深帶，遠(yuǎn)側(cè)深帶可分為3～4條深帶；長臂分為2區(qū)，界標(biāo)為1淺帶（2區(qū)1帶)。長臂深帶寬度略大于短臂深帶。
第4號染色體：短臂有1～2條深帶，只1區(qū)。長臂有均勻分布的4條深帶；長臂分3區(qū)；界標(biāo)為2淺帶（2區(qū)1帶和3區(qū)1帶)。
第5號染色體：短臂有1條深帶，只1區(qū)。長臂有5條深帶，中段的3條深帶�？拷婚L臂分3區(qū)，界標(biāo)有1深帶（2區(qū)1帶)和1淺帶（3區(qū)1帶)。
第6號染色體：短臂近側(cè)有1寬的淺帶，遠(yuǎn)側(cè)為1深帶；短臂分2區(qū)，界標(biāo)為1淺帶（2區(qū)1帶)。
第7號染色體：短臂有2～3條深帶，近末端帶著色很深；短臂分2區(qū)，界標(biāo)為1深帶（2區(qū)1帶)長臂有3條深帶，近側(cè)和中部的2條帶較深；長臂分3區(qū)，界標(biāo)為2深帶（2區(qū)1帶和3區(qū)1帶)。
第8號染色體：短臂有2條深帶，遠(yuǎn)側(cè)深帶較近側(cè)深帶著色深；短臂分2區(qū)，界標(biāo)為1淺帶（2區(qū)1帶)。長臂有3～4條深帶，遠(yuǎn)中的深帶著色較深；長臂分2區(qū)，界標(biāo)為1深帶（2區(qū)1帶)。
第9號染色體：短臂有1～2條深帶；短臂分2區(qū)，界標(biāo)為1深帶（2區(qū)1帶)。長臂2條深帶。長臂分3區(qū)，界標(biāo)為2深帶（2區(qū)1帶和3區(qū)1帶)。
第10號染色體：短臂有2條深帶，近側(cè)較近側(cè)深帶著色淺；短臂只1區(qū)。長臂有3條深帶，近側(cè)深帶著色更深；長臂分2區(qū)，界標(biāo)為1深帶（2區(qū)1帶)。
第11號染色體：短臂有1～2條深帶；短臂只1區(qū)。長臂有2條深帶，在近側(cè)深帶與著絲粒之間有1寬的淺帶；長臂為2區(qū)，界標(biāo)為1淺帶（2區(qū)1帶)。
第12號染色體：短臂有1條深帶；短臂只1區(qū)。長臂有3條深帶，中間的1條深帶寬，近側(cè)深帶與著絲粒的距離較第11號染色體近；長臂分2區(qū)，界標(biāo)為1深帶（2區(qū)1帶)。
第13號染色體：長臂有4條深帶，中間2條深帶寬；長臂分3區(qū)，界標(biāo)為中間的2條深帶（2區(qū)1帶及3區(qū)1帶)。
第14號染色體：長臂有45條深帶，近側(cè)的第2條帶和遠(yuǎn)側(cè)的帶著色更深；長臂分3區(qū)，界標(biāo)為2條深帶（2區(qū)1帶和3區(qū)1帶)。
第15號染色體：長臂有4條深帶，近側(cè)的第2條帶較寬；長臂分2區(qū)，界標(biāo)為1深帶（2區(qū)1帶)。
第16號染色體：短臂有1～2條深帶，短臂只1區(qū)。長臂有2條深帶，近中部深帶明顯；長臂分2區(qū)，界標(biāo)為1深帶（2區(qū)1帶)。
第17號染色體：短臂有1深帶；只1區(qū)。長臂1～2深帶，遠(yuǎn)側(cè)深帶較寬，在深帶與著絲粒之間有1寬的淺帶；分2區(qū)，界標(biāo)為淺帶（2區(qū)1帶)。
第18號染色體：短臂為1淺帶區(qū)。長臂有2條深帶；為2區(qū)，界標(biāo)是1淺帶（2區(qū)1帶)。
第19號染色體：著色最淺。著絲粒周圍為深帶。短臂和長臂均為1區(qū)。
第20號染色體：短臂有1深帶，較寬；短臂和長臂均為1區(qū)。長臂有1深帶，較寬。
第21號染色體：最小的1個染色體。長臂緊按著絲粒處有1深帶，較寬；長臂為2區(qū)，界標(biāo)為1深帶（2區(qū)1帶)。
第22號染色體：較21號色體長，長臂緊接著絲粒處有1深帶，較窄。短臂和長臂均為1區(qū)。
X染色體：短臂中部有1條深帶；分2區(qū)，界標(biāo)是深帶（2區(qū)1帶)。長臂有4條深帶，其中近槽深帶最寬；分2區(qū)，界標(biāo)是近側(cè)深帶（2區(qū)1帶)。
Y染色體：長臂遠(yuǎn)側(cè)半色著深，為1深帶；短臂和長臂均為1區(qū)。
現(xiàn)在國內(nèi)流行一種辨認(rèn)G帶每個染色體的口訣，稍加修改如下：
一禿二蛇三蝶飄，四象鞭炮五黑腰；
六號短空小白臉，七上八下九苗條；
十號長臂近帶好，十一低來十二高；
十三十四十五號，三個長臂一二一；
十六長臂縊痕大，十七長臂帶腳鐐；
十八人小肚皮大，十九中間一黑腰；
二十頭重腳腳底輕，二十一帶寬身體��；
二十二帶小身體大，Y長一寬近末端；
X短臂一、長臂三，中間象個工字般。
1．原理染色體的化學(xué)成份是核酸和蛋白質(zhì)兩部分。核酸以DNA為主，蛋白質(zhì)有組蛋白和非組蛋白兩種。因此染色體經(jīng)蛋白水解酶類物質(zhì)處理后，蛋白質(zhì)已被水解而使DNA分子中堿基暴露，由于堿基中G/C和A/T組合的比例不同，對染料結(jié)合的程度不一，如這一段A/T堿基的成份多，則Giemsa染料易與它結(jié)合成深染；另一段G/C堿基的成份多，則Giemsa染料不易與其結(jié)合，結(jié)果成淡染，由于整條染色體上A/T和G/C的分布不勻，這樣在染色體上呈現(xiàn)出深淺不一的條紋或者稱帶紋，該技術(shù)用Giemsa染色，故其帶型稱為G帶。
2．操作過程
（1)按常規(guī)染色體技術(shù)制片。
（2)制好的染色體玻片，在80℃烘箱中，烘烤2h，置于室溫。
（3)4℃冰箱PBS液5min。
（4)4℃冰箱PBS緩沖液含胰蛋白酶終濃度0.025%，消化10min。
（5)蒸餾水洗凈胰酶。
（6)Giemsa染色20min。
（7)蒸餾水洗凈染色液，晾干鏡檢。
4℃低溫胰酶處理片子，其優(yōu)點是：時間較長，易掌握。配制1次試劑可用1～2個月。
1．原理常規(guī)的G帶顯帶技術(shù)，在人類染色體中僅觀察到320～450條帶紋，對于一些染色體細(xì)微結(jié)構(gòu)異常的識別是不夠的。
氨甲碟呤抑制二氫葉酸還原酶，阻止葉酸轉(zhuǎn)變?yōu)樗臍淙~酸，從而干擾了脫氧胸腺嘧啶核苷酸的合成，阻止了DNA的復(fù)制，使細(xì)胞被阻止在S期內(nèi)。胸腺嘧啶核苷解除氨甲喋呤的作用，讓被阻滯的細(xì)胞同時開始進行DNA復(fù)制，進而同步分裂；放線菌素D可增加染色體的長度，能顯示更多的亞帶。放線菌素D與核酸相互作用：①插入脫氧鳥嘌呤核苷酸和脫氧胞啶核苷酸之間，使DNA變長；②能與染色體縮短有關(guān)的特殊蛋白和DNA結(jié)合，因此，抑制了染色體正常的收縮過程。秋水仙胺抑制紡垂絲的形成，可以得到較多的晚前期、前中期、早中期的分裂相。這樣染色體帶紋可增加到500和850條，甚至可達1200～2000條之多。這一步對于研究較細(xì)小的染色體缺陷的基因定位，具有很大的意義。
2．材料和方法
（1)4ml培養(yǎng)液（為從日本進口的RPMi 1640或從美國進口的F10液)雖自制的小牛血清1ml。每ml加青、鏈霉素各100單位，pH=7.2。
（2)每瓶培養(yǎng)液內(nèi)，另加自制的PHA或重慶產(chǎn)的PHA2.5mg。
（3)取外周血2ml，分別裝入含培養(yǎng)液的4個培養(yǎng)瓶內(nèi)。
（4)37℃孵育箱內(nèi)培養(yǎng)72h。
（5)加入氨甲喋呤，最終濃度10-7mol/L，繼續(xù)培養(yǎng)17h。
（6)用不含血清的培養(yǎng)液沖洗兩次后，將上清液吸出，再加入含胸腺嘧啶核苷（最終濃度為10-5mol/L)的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)3h。
（7)再加入放線菌素D，最終濃度為3μg/ml，培養(yǎng)2h。
（8)加秋水仙胺，最終濃度為0.03μg/ml，培養(yǎng)2h。
（9)按常規(guī)染色體技術(shù)制片。
（10)按一般常用的G帶顯帶技術(shù)，顯示帶紋。
3．注意事項
（1)高分辨染色體，重疊多，應(yīng)增加固定次數(shù)和固定時間，可置于4℃冰箱存放24h后制片，用高距離滴片，以使染色體分散開。
（2)細(xì)胞培養(yǎng)液同步化后，如果用5-溴-2脫氧尿核苷（5-bromodeoxyuridine,BrdU)，則需加黑物包裝進行暗培養(yǎng)。
1．國內(nèi)應(yīng)用的外周血培養(yǎng)染色體技術(shù)
（1)原理：外周血染色體制備是目前應(yīng)用最廣泛的細(xì)胞遺傳學(xué)診斷技術(shù)，亦是基本的實驗技術(shù)，由于取材容易，培養(yǎng)過程比較簡單，短期內(nèi)可以得到結(jié)果，所以其實用價值很高。
血液中含有紅、白兩類細(xì)胞，它們均是處于未分裂的間期細(xì)胞。紅細(xì)胞沒有核，無分裂能力；白細(xì)胞類雖有細(xì)胞核存在，但是外周血中處于休止期。植物血球凝集素（簡稱PHA)能促使淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有分裂作用的母細(xì)胞。染色體只有在細(xì)胞分裂中期時最典型。秋水仙素類藥的藥物能抑制紡錘絲的形成，使細(xì)胞分裂停止于中期，低滲處理使細(xì)胞膨脹，細(xì)胞膜破裂，染色體分散，這樣就可便于分析。
簡意流程圖：
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（2)操作過程
①采血：無菌干針筒從靜脈取血1～2ml，用肝素抗凝（約每毫升全血內(nèi)含肝素100單位)。
②培養(yǎng)液配制：RPMI 1640 4ml
小牛血清 1ml
1%PHA（自制)0.2ml
調(diào)節(jié) pH為7.4后置于-20℃冰箱
③標(biāo)本接種：每5ml培養(yǎng)液加入抗凝全血0.5ml。
④培養(yǎng)細(xì)胞：將接種好的培養(yǎng)瓶置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)72h。
⑤阻止分裂：培養(yǎng)至68h，加秋水仙素，最終濃度0.02μl/ml，搖勻后置于37℃恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h。
⑥收獲：培養(yǎng)物混合后，置于10ml離心管內(nèi)，離心10min（1000轉(zhuǎn)/min)，去上清液。留下培養(yǎng)物。
⑦低滲處理：低滲液可用0.56%的KCl（或0.075mol/l KCl)5～7ml，用吸管打散沉淀物，置于37℃水浴箱中保溫20min，然后加入固定液（3份甲醇：1份冰乙酸)1ml用吸管打勻，預(yù)固定1～2min。
⑧離心：1000轉(zhuǎn)/min離心10min。
⑨固定：吸去上清液，留下沉淀加上述固定液6～8ml，用吸管將沉淀物打散，固定30min后離心，1000轉(zhuǎn)/min離心10min，取出吸去上清液留下沉淀。
⑩重復(fù)上述固定離心1次。
⑾標(biāo)本制作：最后1次固定、離心后吸去上清液，留下沉淀再加少量新鮮固定液約0.3ml打散細(xì)胞懸浮液即可進行制片。制片之前先將載玻片經(jīng)清潔液洗凈處理后，置于冰箱內(nèi)制成冰片。取冰片1張滴上2～3滴細(xì)胞懸液。利用冰片的表面張力關(guān)系使液體迅速向玻片四周散開，與此同時用嘴輕輕吹向滴片處，以助其更快散開，然后在酒精燈火上通過7～8次后，自然干燥或烤干均可。
⑿染色：Giemsa染液1份和pH7.4磷酸緩沖液9份，混合后，染色20min，蒸餾水洗去余下染液，晾干，鏡檢觀察。
（3)注意事項
①無菌操作是關(guān)鍵。培養(yǎng)液不得污染。
②所用藥品不得失效，特別是PHA，既要使淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，又不能過量。
③小牛血清優(yōu)質(zhì)、無菌。
④秋水仙清素低濃度4～6h效果最佳，過量則染色體易收縮。
⑤固定液和Giemsa染液要求新鮮配用。
⑥培養(yǎng)時間72h較好。
（4)各種物品清洗與消毒
①玻璃器皿用后，立即用自來水沖洗，再用洗衣粉刷洗，然后用自來水沖洗。待干，泡入清潔液24～48h，取出，自來水沖洗，再用雙蒸水沖洗，干后備用。
②接觸洗液時，帶上橡皮手套，圍裙等防護品。
常用清潔液配制：
重鉻酸鉀25g
水200ml
濃硫酸1000ml
③先將重鉻酸鉀在水中溶解，然后慢慢加入濃硫酸，邊加邊攪拌，防止過度發(fā)熱。使用3～6月后檢查，若變綠表示失效。
④G5、G6漏斗的處理：水洗凈、晾干，于濃硫酸泡（或洗液中泡)24h，再用蒸餾水沖洗至加入1%BaCl2滴無白色沉淀為止。包裝消毒，15磅20min。
（5)橡皮塞的處理
新的橡皮塞洗后，先用0.5N NaOH煮沸15min，再用0.5n HCl煮沸15min，流水沖洗10min，用雙蒸水泡24h，雙蒸水沖洗，晾干，15磅20min高壓滅菌。
（6)金屬器械清洗
先用紗布或紙擦去防銹油，然后用洗滌液清洗，再用清水或蒸餾水洗凈，擦干或烘干備用。
2．外周血細(xì)胞培養(yǎng)法（Bhatt B and McGee JOD,1990)
（1)收集靜脈血（無菌)，加肝素抗凝（20單位/ml)；
（2)加0.8ml全血入每個培養(yǎng)瓶（含10ml培養(yǎng)液)，37℃培養(yǎng)72h；
培養(yǎng)液配制：RPMI 76ml(Gibco,Cat.No.041-1875M)
小牛血清 20ml
PHA 2.0ml
（3)加100μl Brdu于培養(yǎng)瓶中，37℃再孵育16～17h；
（4)離心（1200rpm)8min，棄去上清液，沉淀中加入10ml RPMI 1640培養(yǎng)液，混勻；
（5)重復(fù)步驟（4)；
（6)沉淀中加入10ml新配制的完全培養(yǎng)液（含2.5μg/ml胸腺嘧啶)，重新置于37℃孵育6～7h；
（7)在收獲培養(yǎng)細(xì)胞前15～30min，可加Colcemid,但當(dāng)同時應(yīng)用BrdU時這就并非十分必要。因為BrdU是胸腺嘧啶核苷的類似物，能使染色體在富含異染色質(zhì)處斷裂分解，從而使顯帶明顯；
（8)1200rpm離心培養(yǎng)細(xì)胞，棄去上清液，加入1ml 0.56% KCl（事先預(yù)熱至37℃)，繼續(xù)加入0.56%KCl使總?cè)萘窟_到10ml，在37℃孵育10min；
（9)如上述離心，棄去上清液，在沉淀的細(xì)胞內(nèi)加入新鮮的冷固定劑，（甲醇：冰醋酸=3：1，新鮮配制，保存在冰上)，置冰上至少20min；
（10)重復(fù)步驟（9)3～4次，直至細(xì)胞懸液清潔無色；
（11)可較長期保存在冰的固定劑內(nèi)（-20℃)或再離心后加入0.5～1.0ml新鮮固定劑，置于冰上；
（12)玻璃載片放在Decon（清潔液)或其它的清潔液內(nèi)過夜，次日用自來水沖洗，繼之蒸餾水漂洗，在60～75℃干燥，然后把載片孵育在2%丙酮液內(nèi)，室溫，60min。自來水沖洗，再在60～75℃干燥；
（13)每張載片上加10μl的細(xì)胞混懸液，空氣干燥，在24h后可應(yīng)用于雜交實驗，也可保存在-4℃達8周之久（試劑配制法見附錄四)。
（一)基本原理
染色體上基因位置分配的研究，又叫染色體圖的研究，包括基因名稱、基因在染色體的位置及與相鄰基因的距離及其核酸序列的研究。研究基因圖的方法包括家系的連鎖分析法、體細(xì)胞雜交法、重組DNA技術(shù)和原位雜交法。果蠅的線形基因圖和大腸桿菌、T4噬菌體兩者的環(huán)狀基因圖都已繪成，目前正致力于人類基因圖的繪制。人類基因約有5萬～10萬個，根據(jù)第八次國際人類基因定位工作會議，已定位的人類基因總數(shù)達1479個。
ISHH技術(shù)對染色體基因圖的研究，是用同位素或生物素、地高辛標(biāo)記的核酸探針，直接同中期的染色體鋪片行雜交。早期的研究是用于重復(fù)序列DNA的定位，如編碼核糖體的基因18S和28S核糖體RNA定位于第13～15號染色體和第21～22號染色體短臂次縊痕區(qū)。5S核糖體RNA定位于第1號染色體上長臂的遠(yuǎn)側(cè)Iq42～Iq43。近年已能進行單拷貝基因的定位，如胰島素基因定位于IIp 15上、C-mos原癌基因定位于Sq22上、N-ras原癌基因定位于IPI34。在染色體11的短臂上，利用ISHH技術(shù)證明4個基因依次排列，從短臂的遠(yuǎn)端依次為胰島素、β-球蛋白、HRASI和PTH。
（二)操作步驟（Bhatt and MCGee, 1990)
在前面已介紹了制備血培養(yǎng)染色體鋪片的方法。下面介紹的是在染色體制片上用免疫金銀染色法進行原位雜交的基因定位顯示、結(jié)合Giemsa染色顯帶技術(shù)的操作步驟。
1．移除內(nèi)源性RNA
（1)加100μl RNA酶溶液，覆以蓋玻片，放在有少許2×SSC溶液的濕盒內(nèi)孵育，37℃，60min。
（2)在2×SSC溶液內(nèi)移除蓋玻片，以2×SSC洗2×3min。
（3)等級酒精系列脫水，10%，50%，70%，90%和100%，各1min，各1min。空氣干燥。
2．探針標(biāo)記和純化用缺口平移法將生物素11-dUTP標(biāo)記在DNA核酸探針上。
3．變性與雜交
加20～100ng生物素標(biāo)記探針到雜交液中，加入5μl 20mg/ml人或鯡魚精子DNA，總?cè)萘繛?0～40μl，離心5s，混勻后，滴于染色體鋪片，覆以蓋玻片，蓋片四周以橡皮泥封固。放入盛2×SSC溶液溫盒內(nèi)75℃7～8min，使之變性，繼之于37℃孵育16h。
4．雜交后漂洗2×SSC溶液內(nèi)移除蓋玻片，將載片浸入含50%甲酰胺的2×SSC溶液內(nèi)，pH7.2,20min,42℃。然后作下列程序漂洗
溶液 漂洗時間溫度
2×SSc 20min42℃
1×SSC20min 室溫
0.1×SSc 20min 室溫
5．免疫細(xì)胞化學(xué)顯示
（1)孵育載片于PBt 15min，將片緣及背面擦干，加100μl一抗于載片（兔抗生物素抗血清1：100，以PBT稀釋)，孵育于37℃40～60min。
（2)快速用PBT沖洗，擦干片緣及背面，加100μl二抗抗血清（羊抗兔IgG結(jié)合10～20nm金粒，以PBT1：50稀釋)于載片染色體鋪片部位，37℃孵育45～60min。
（3)PBS洗3×5min。
（4)蒸餾水洗3×5min。
（5)加數(shù)滴銀溶液于載片上，在光鏡下監(jiān)測，大約需5～18min可見在染色體上出現(xiàn)銀斑點。
（6)蒸餾水洗。PBT配制見附錄3。
6．顯帶復(fù)制（Replication banding)
（1)應(yīng)用5μg/ml Hoechst 33258在2×SSC溶液內(nèi)，暗室中染載片20min。
（2)蒸餾水洗，以2×SSC封固，覆以蓋玻片，蓋片四周封以橡皮泥。
（3)紫外光照射1～16h。
（4)蒸餾水洗和以10%Giemsa（磷酸緩沖液稀釋，pH6.8～7.2)染色10min。
（5)蒸餾水沖洗，空氣干燥，以DPX封固。
（6)光鏡下觀察，可見棕色的銀斑點在染色體上的定位，并顯示其與染色體分帶的關(guān)系。
（一)基本原理
在惡性的或癌前病變的組織，染色體組含量與結(jié)構(gòu)的畸變在部分病例中與疾病的預(yù)后相一致。由于染色體基因的變化可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生與進展，利用一些技術(shù)預(yù)測這些遺傳物質(zhì)的變化可為惡性腫瘤的檢測及了解其進展和預(yù)后提供資料。流式細(xì)胞計（FCM)和染色體組型，即核型分析（karyothping analyses)等技術(shù)曾被用于這個領(lǐng)域的研究。FCM可測定腫瘤細(xì)胞DNA的含量，但它不能顯示特異性染色體的結(jié)構(gòu)異常，而且對微量的DNA含量改變難以檢測。核型分析可以顯示染色體結(jié)構(gòu)和含量的變化，但要分析腫瘤細(xì)胞的核型只有在細(xì)胞培養(yǎng)以后。細(xì)胞培養(yǎng)時細(xì)胞的高度分裂指數(shù)和細(xì)胞的生長會導(dǎo)致染色體物質(zhì)的丟失，而且核型分析不能顯示特異性DNA探針的原位雜交技術(shù)，能夠檢測在細(xì)胞分裂間期細(xì)胞核內(nèi)染色體數(shù)量和結(jié)構(gòu)的異常變化。因此，這項技術(shù)又被稱為“間期細(xì)胞遺傳學(xué)分析法（Interphase Cytogenetics Analysis, ICA)。間期細(xì)胞遺傳學(xué)的基本原理是利用合成的特異性DNA探針，標(biāo)記以同位素、生物素、地高辛或熒光素，對外周血、腫瘤細(xì)胞或癌前組織的離散培養(yǎng)細(xì)胞的染色體鋪片或切片進行DNA-DNA原位雜交，其雜交定位以熒光法、放射自顯影或免疫組化法顯示。目前ICA已廣泛應(yīng)用于生前診斷、腫瘤組織活檢材料的診斷和基因異常的診斷。在腫瘤細(xì)胞方面，在乳腺癌，神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、睪丸腫瘤，婦科腫瘤和膀胱腫瘤等均有實驗報告�，F(xiàn)已能提供的DNA探針有染色體1，7，8，9，10，15，16，17，18和性染色體X、Y，以及識別一些染色體特征性部位如著絲點（centromeric region)、染色體端極區(qū)（telomere region)的特異性重復(fù)靶核苷序列和隨體的DNA探針，多數(shù)為合成的寡核苷酸探針，在應(yīng)用上采取ISHH和FCM以及免疫組化相結(jié)合（有時還結(jié)合核型分析)的綜合研究法（圖21-2)，也可用多種標(biāo)記物顯示不同顏色或不同標(biāo)記在一張切片上同時顯示多個染色體的結(jié)構(gòu)或DNA含量異常，如異硫氰酸熒光素（FITC)和羅丹明200結(jié)合，前者顯示黃綠色，后者顯示紅色，ABC-DAB顯示法與地高辛-堿性磷酸酶系統(tǒng)相結(jié)合，前者反應(yīng)物為棕色，后者為紫藍色。這種聯(lián)合應(yīng)用法又叫多靶點原位雜交法（multiple-target ISH)。
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圖21-2 腫瘤組織處理流程圖
（二)基本操作方法
1．玻片與組織前處理
（1)腫瘤細(xì)胞混懸液的制備：新鮮的從活檢或外科手術(shù)或尸檢獲得的材料建議按圖21-2的流程處理進行綜合研究。用以制作細(xì)胞混懸液的組織在處理前可保存于液氮內(nèi)。組織塊在玻皿中切碎或用細(xì)胞打碎機打碎，用100μm孔直徑的尼龍網(wǎng)過濾器濾過，固定在70%乙醇，-20℃，如保存于-39℃可保存數(shù)月至數(shù)年。
（2)分離的細(xì)胞由于表面有細(xì)胞質(zhì)的覆蓋，在熒光顯微鏡下會顯示強烈的自動熒光，從而掩蓋了ISHH的信號。可采取下列兩種方法移除覆蓋的細(xì)胞質(zhì)；
①乙醇固定后的細(xì)胞，應(yīng)用以前在新鮮制備的甲醇/醋酸（3：1)固定液內(nèi)0℃，5min。滴2～3滴固定后的細(xì)胞混懸液于涂有粘附劑的載片上，空氣干燥，然后快速浸入70%醋酸內(nèi)10～60s。應(yīng)用蒸餾水洗，在100%乙醇內(nèi)脫水，空氣干燥。
②應(yīng)用胃蛋白酶蛋白水解作用。加5μl細(xì)胞混懸液于載片上，空氣干燥30min或在80℃烤箱中干燥。胃蛋白酶（2500～3500單位/mg蛋白質(zhì)，Sigma,USA)應(yīng)用0.01mol/L HCl稀釋至50～400μg/ml，10min 37℃；再用0.03% H2O2和PBS漂洗，以4%多聚甲醛固定，0℃，5min；載片脫水，空氣干燥，在80℃加熱變性30min。這個方法較①更好，能移除蛋白質(zhì)、暴露核DNA和有助于探針的穿透，最重要的能較好的保持形態(tài)學(xué)的結(jié)構(gòu)，以利于ISHH的熒光信號的顯示。應(yīng)用①法，細(xì)胞經(jīng)常呈扁盤狀，而且細(xì)胞質(zhì)的自動熒光未完全消失，影響ISHH熒光信號的顯示，但實驗表明，必須嚴(yán)格掌握胃蛋白酶的濃度，過低，由于細(xì)胞質(zhì)的覆蓋，基因拷貝數(shù)會減低，而過高濃度的胃蛋白酶會導(dǎo)致過度消化影響細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)。
（3)組織切片處理
①冷凍切片：切片厚5μm，放置有粘附劑的載片上，空氣干燥，固定在4%多聚甲醛-PBS溶液，0℃，15min。固定后以PBS和0.01n HCl漂洗，以胃蛋白酶（20～100μg/ml，用0.01N HCl配制)，37℃，30min，PBS漂洗2×5min，在4%多聚甲醛內(nèi)固定15min（0℃)，PBS洗2×5min，系列等級乙醇脫水，空氣干燥。雜交前，在80℃加熱30min使之變性。
②石蠟切片：切片厚5μm，漂洗在40℃溫水中，撈片于有粘附劑的載片上，空氣干燥，56℃加熱1～16h，二甲苯脫蠟2×3min甲醇沖洗2×5min。應(yīng)用1%H2O2（用甲醇配)溶液封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性。以甲醇沖洗，空氣干燥，以胃蛋白酶（4mg/ml,用0.2n HCl配)37℃ 30min。消化后，載片以PBS沖洗。在雜交前，載片孵育于1%甘氨酸溶液-PBS中15min，以PBS沖洗和系列酒精脫水，空氣干燥。載片在80℃孵育30min使之變性。
2．雜交本實驗的雜交液略區(qū)別于其它實驗，否則染色體1號和18號的DNA探針不僅結(jié)合1號和18號染色體，還會同時結(jié)合染色體9，6，13，21。雜交液配方：
甲酰胺 60%（V/V，2×SSC配，pH5.0)
鯡魚精子DNA 1μg/μl
余與一般雜交液配制相同
對多靶點ISHH，須另加入1mmol/L KCN入雜交液，每張載片加5μl的含特異性DNA探針（2.5ng/μl)的雜交液，以蓋片覆蓋，四周用橡皮泥封固，先在80℃熱板上5～10min使DNA變性，細(xì)胞混懸液制片變性時間只需2.5min，然后在37℃雜交，孵育過夜。
3．雜交后漂洗同本節(jié)�。ǘ�)雜交后漂洗步驟。
4．顯示步驟根據(jù)標(biāo)記物的種類（同位素、熒光素、生物素或地高辛)分別進行顯示（與第二十章 中敘述相同)。
5．結(jié)果在光鏡下可見染色體結(jié)構(gòu)的改變，如在膀胱腫瘤細(xì)胞，其DNA含量經(jīng)FCM顯示高于正常組織1倍，在雙靶ISHH顯示載片上，可見腫瘤細(xì)胞間期核內(nèi)，1號染色體為3倍體，而18號染色體為2倍體。在腫瘤細(xì)胞內(nèi)應(yīng)用雙重靶點或多重靶點ISHH技術(shù)可見細(xì)胞間期核內(nèi)多個染色體的眾多畸變相。
ISHH技術(shù)作為一項快速與敏感的偵檢細(xì)胞間期細(xì)胞核內(nèi)染色體畸變的新技術(shù)，可結(jié)合病理材料的常規(guī)組織切片、免疫組化染色和FCM等對病檢材料做出早期的、準(zhǔn)確的診斷，并對腫瘤的預(yù)后與進展等有所了解。本技術(shù)成功的關(guān)鍵在于具有特異性的DNA探針和ISHH的偵檢程序，比如染色體的拷貝數(shù)與腫瘤細(xì)胞前處理的方法有關(guān)，如移除蛋白質(zhì)不徹底，就會使偵檢到的染色體拷貝數(shù)減少。又如在切片上進行細(xì)胞間期染色體的ISHH時，常見到一些細(xì)胞核碎片呈不同形狀的斑點狀（在涂片上不會出現(xiàn)此種圖像)。對ISHH所獲得資料的分析，須經(jīng)過反復(fù)的實踐，比如模糊的或分裂的斑點可以是非整倍體（aneuoploidy)的假陽性反應(yīng)，產(chǎn)生于細(xì)胞周期的G2期。
（一)基本原理
利用性染色體X或Y的特異性DNA探針的ISHH技術(shù)進行胎兒生前（Prenatal)性別的診斷，樣品取自于羊水、絨毛或胎兒的血液。近年，科技工作者又成功地進行了胚前（pre-embry－o)或植入前（preimplantation)的ISHH診斷。所謂胚前診斷是在受精卵植入子宮內(nèi)膜前的4～6細(xì)胞期，以顯微操縱器（micromanipulator)或微型吸管穿破透明帶，將分裂球或其中的部分細(xì)胞吸出放入培養(yǎng)液內(nèi)，應(yīng)用ISHH技術(shù)進行性染色體的分析，如有染色體畸形，可及早移除，避免以后進行人工流產(chǎn)術(shù)。本技術(shù)可還用于鑒別精子是帶X或Y染色體。如果1個婦女遺傳性基因是與X染色體相聯(lián)系的，那么可給予人工授精只帶X染色體的精子以避免其子代有遺傳疾病的危險。當(dāng)然帶X染色體的精子的分離技術(shù)還有待于研究和建立。目前這還是一種實驗性設(shè)想。羊水可在16～20周妊娠期吸取。在18～19周時，20ml的羊水內(nèi)大約含100萬個細(xì)胞，含大約7μgDNA。絨毛膜的絨毛可在3～6月取，每次可獲5～50mg的組織。應(yīng)注意在應(yīng)用前清除母體細(xì)胞。胎血0.2～0.7ml可在17～40周采取，在15～21周，胎血中含2×109白細(xì)胞/L和類似數(shù)量的有核紅細(xì)胞（Miller et al, 1985)。在32～34周，有核紅細(xì)胞的比例數(shù)降至0～50/每100個白細(xì)胞。這種以性染色體為探針的ISHH技術(shù)，可應(yīng)用于分裂中期的染色體鋪片上，也可以應(yīng)用于間期細(xì)胞核制片。性染色體ISHH技術(shù)在下列場合特別有用，如（1)當(dāng)無足夠的分裂細(xì)胞供可靠的細(xì)胞遺傳學(xué)分析時；（2)當(dāng)胎兒面臨性染色體連鎖遺傳性疾病的危險而需做迅速的性別確定時；（3)協(xié)助鑒別45，X/46，XY鑲嵌和其它異常染色體的鑲嵌類型；（4)當(dāng)一雌性具有一Y染色體的雜交時，應(yīng)檢查其父母的血樣品，因為在正常情況下有部分的雄性具有2個Y染色體。這里只敘述了性染色體在ISHH技術(shù)的應(yīng)用，如用同樣技術(shù)標(biāo)記其它染色體也可能對其它遺傳性疾病進行診斷，如Julien等（1986)曾應(yīng)用染色體21號DNA探針于間期細(xì)胞核，出現(xiàn)3倍體，為常見遺傳性疾病Down氏綜合征的診斷特征（發(fā)病率為1/700出生者)，同樣，在Edward氏綜合癥（遺傳性疾病出現(xiàn)率1/3000出生者)顯示18號染色體為3倍體。West實驗室進行了大量的性染色體的ISHH實驗，并比較了各種標(biāo)記物的優(yōu)缺點，他經(jīng)反復(fù)實驗后承認(rèn)非放射性同位素標(biāo)記物如生物素、地高辛具有許多優(yōu)點，但在性染色體的ISHH顯示，他認(rèn)為至少在他的實驗室同位素3H的標(biāo)記優(yōu)于其它的標(biāo)記物。
（二)基本操作方法
1．Y染色體3H標(biāo)記DNA探針原位雜交技術(shù)
（1)探針標(biāo)記，以3H標(biāo)記Y染色體DNA探針（詳見第19章 )。
（2)原位雜交
①RNA酶的前處理：取1ml RNA酶保存液（10mg/ml)于250ml 2×SSC內(nèi)，預(yù)熱于37℃水浴中。選具有適量的細(xì)胞分布的載片孵育于稀釋的RNA酶溶液中，37℃，1h。系列等級乙醇脫水，70%，90%，100%乙醇各2min，空氣干燥。
②相當(dāng)250ml的預(yù)雜交液（含70%甲酰胺，0.6×SSC配)，70℃水浴。置載片于此預(yù)雜交液內(nèi)2min以使靶DNA變性，如（1)經(jīng)系列等級乙醇脫水，空氣干燥。
③DNA探針準(zhǔn)備與變性
雜交液：10×SSC20%
tRNA 10%
甲酰胺 50%
硫酸葡聚糖 20%
DNA探針-3H 20%
均勻混合，70℃水浴5min使探針變性，然后迅速置冰上冷卻。
10×SSC：1.2mmol/L NaCl
0.15mmol/L醋酸鈉
0．2mol/L NaPO4
tRNA(SigmaR1759)4mg/ml(用TE緩沖液配)，-4℃保存。
TE緩沖液：10mmol/L Tris,1mmol/L EDTA,Ph7.5。
每張載片加20μl含探針的雜交液，覆以蓋玻片，四周用橡皮泥封固，于37℃孵育過夜。可測定3H的放射比性，以了解每張載片的探針含量。
④雜交后漂洗，次日移除蓋玻片，用緩沖液39℃漂洗
50%甲酰胺1×SSC 4×5min
1×SSC 39℃ 4×5min
⑤系列等級乙醇脫水，70%，90%，100%各2min，空氣干燥。
（3)放射自顯影（詳見二十章 第一節(jié) )：浸入核乳膠，暗盒于冷室或4℃冰箱儲存，顯影，定影，復(fù)染，封固和觀察。應(yīng)用3H標(biāo)記pHY2.1DNA探針，其曝光時間大約為6～7日。
2．雜交前精子的處理
（1)取1ml用緩沖液清洗過的精子，加1ml 6mmol/L EDIT(60μl 0.2mol/L EDTA加1940μl的BWW培養(yǎng)基)。留置于室溫5～10min，離心（1000rpm(175×g)5min。
（2)棄上清液，沉淀的精子內(nèi)加1ml 2mmol/L DTT(dithiothretiol, DTT,二硫蘇糖醇)，配法：154μl的DTT加1846μl(4g/ml)BWW培養(yǎng)基（Gibbers et al, 1971)，置室溫45min,再離心1000rpm 5min。
（3)棄上清液，用BWW培養(yǎng)基再稀釋、離心。
（4)加新鮮配制固定劑（甲醇：醋本以=3：1)，反復(fù)混勻或置于漩渦式的混勻器上混勻，室溫30～60min，離心。
（5)加數(shù)滴新鮮固定劑于離心管中，如上再混勻。迅速從混勻液中取2～3滴精液滴于載玻片上，空氣干燥，以相差顯微鏡檢查確有精子存在，保存在清潔的干盒中備用。
（6)在ISHH以前，取出載片，加數(shù)滴0.05% SDS(20μl 0.05% SDS/每2ml BWW培養(yǎng)基)，靜置5min，傾去SDS（十二烷基磺酸鈉，配制法見附錄2)，以2×SSC漂洗，系列等級乙醇脫水，70%，90%，100%各2min，空氣干燥。
（7)雜交步驟同上，雜交后以0.5%伊紅黃（Eosin yellow)復(fù)染，自來水沖洗，空氣干燥，DPX封固。
本節(jié) 簡要介紹了ISHH技術(shù)在染色體鋪片應(yīng)用的三個方面，并摘要介紹了它們的應(yīng)用及操作方法。由于這一技術(shù)在國際上也處于剛起步階段，其發(fā)展主要在近10年，國內(nèi)尚未開展，因此，此一技術(shù)的應(yīng)用還有待于不斷的摸索與完善。必須說明的是ISHH在染色體制片的應(yīng)用也需設(shè)置對照實驗組（詳見第二十章 第一節(jié))。
