動脈粥樣硬化:第四節(jié)　氧化低密度脂蛋白

天然的低密度脂蛋白（LDL)經(jīng)氧化修飾形成的脂蛋白，稱為氧化低密度脂蛋白（OxLDL)。天然LDL核心的脂肪酸中含有大量不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids,PUFAs)約占LDL總脂肪酸含量的35%～70%，所以容易發(fā)生自身氧化。

LDL中的PUFAs在自由基或其他氧化劑作用下，生成脂類自由基，并能產(chǎn)生更多的過氧化脂質(zhì)，引起連鎖的自由基鏈式反應(yīng)，最終生成多種反應(yīng)性的醛。這些化學性質(zhì)活潑的醛和ApoB發(fā)生結(jié)合，產(chǎn)生新的抗原決定簇，形成氧化LDL。OxLDL與動脈粥樣硬化關(guān)系密切。

一、修飾的LDL與巨噬細胞泡沫化

從動脈粥樣硬化發(fā)病機制，我們不難發(fā)現(xiàn)LDL在動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展中起非常重要的作用。

（一)內(nèi)皮細胞俘獲LDL和巨噬細胞泡沫化

高脂血癥、脂質(zhì)代謝失常是動脈粥樣硬化的重要病因。血漿中增多的脂質(zhì)以LDL的形式經(jīng)完整的內(nèi)膜侵入內(nèi)皮下，這一過程呈現(xiàn)LDL濃度依賴性，無需受體介導。另有觀點認為，機械因子、化學因子、免疫因子、毒素或感染因子對內(nèi)皮的損傷，導致LDL-膽固醇攝取增多。這又反過來會改變內(nèi)皮細胞和循環(huán)血細胞（單核細胞、血小板)的表面特性，促進單核細胞粘附于血管內(nèi)皮，并轉(zhuǎn)變?yōu)榫奘杉毎�，轉(zhuǎn)變后的巨噬細胞更有能力攝取更多的脂質(zhì)，在內(nèi)皮下被俘獲的天然的LDL可以經(jīng)歷兩種形式的修飾，即衍化和氧化，如圖9-6所示。

圖9-6 LDL的修飾在內(nèi)皮下間隙，被俘獲的天然的LDL可能經(jīng)歷兩種形式的修飾-衍化（MAD粘附于ApoB-100或者ApoB-100的糖基化)、氧化（ApoB-100被過氧化物降解)，分別形成衍化的LDL和氧化的LDL。

天然LDL在正常情況下，由LDL受體識別。LDL和LDL受體結(jié)合后，內(nèi)吞入細胞，與溶酶體結(jié)合。在溶酶體酶的作用下，蛋白質(zhì)降解為氨基酸，膽固醇酯水解為游離膽固醇和脂肪酸。此受體受到細胞內(nèi)膽固醇含量的下降調(diào)節(jié)，當細胞內(nèi)膽固醇的含量增多時，LDL受體的量便會減少。所以，天然LDL經(jīng)這一途徑代謝，不會引起膽固醇酯在細胞內(nèi)堆積。

LDL還可以通過清道夫受體途徑代謝。這一受體主要參與修飾的LDL的代謝，沒有下降調(diào)節(jié)的特點，不受細胞內(nèi)膽固醇的含量的應(yīng)答。通過此途徑，修飾LDL被攝取和降解的速度都比正常LDL快。所以LDL這一代謝途徑直接參與動脈粥樣硬化中泡沫細胞的形成，如圖9-7所示。

圖9-7 泡沫細胞的形成巨噬細胞通過修飾LDL受體途徑攝�。ㄏ�化)修飾的LDL。導致大量的負荷脂質(zhì)的小滴進入，泡沫細胞的形成是動脈粥樣硬化進程中脂肪紋形成的標志。

（二)LDL的氧化修飾

1．LDL氧化修飾的形式

（1)細胞介導的LDL氧化修飾

1981年，Henriksen等人將兔主動脈內(nèi)皮細胞和LDL孵育一段時間后，發(fā)現(xiàn)該LDL被巨噬細胞攝取的速度較未與內(nèi)皮細胞共同孵育的LDL快，而且在孵育的基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了硫代巴比妥酸反應(yīng)物（TBARS)，據(jù)此，認為內(nèi)皮細胞可以氧化修飾LDL。這是細胞介導的LDL氧化修飾，又稱生物氧化修飾的LDL。后來發(fā)現(xiàn)除內(nèi)皮細胞外，巨噬細胞、血管內(nèi)膜平滑肌細胞、單核細胞都可以氧化修飾LDL。

（2)過度金屬離子介導的LDL氧化修飾

過度金屬離子Ca2+、Fe²⁺等，在體外適宜條件下與LDL孵育一段時間后，也能使LDL發(fā)生氧化變構(gòu)。因為這是利用化學物質(zhì)氧化LDL，故稱為化學氧化修飾的LDL。

（3)其他形式的氧化修飾

還可以使用物理學方法如紫外線、鈷60對LDL進行氧化修飾。利用過氧化酶類也可能使LDL轉(zhuǎn)變成OxLDL。

2．氧化修飾的過程

LDL的氧化可人為劃分為三個階段。最初為遲滯階段，消耗內(nèi)源性抗氧化劑（VitE)；增殖階段，PUFAs快速氧化為脂質(zhì)氫過氧化物；分解階段，脂質(zhì)氫過氧化物轉(zhuǎn)變?yōu)榉磻c性的醛。這些醛包括丙二醛（MDA)、4-羥烯酸（4-HNE)等，并可以和ApoB發(fā)生共價結(jié)合（主要和ApoB的賴氨酸殘基結(jié)合)，形成新的抗原決定簇。OxLDL喪失與天然LDL受體結(jié)合的能力，被清道夫受體所識別。

3．氧化修飾后LDL理化的生物學特性

OxLDL不同于天然LDL。OxLDL內(nèi)維生素E含量下降，游離氨基減少，瓊脂糖電泳速率增快。LDL中所含的大量卵磷脂轉(zhuǎn)變?yōu)槿苎�卵磷脂。氧化修飾程度低時，ApoB以分解為主。修飾程度高時，降解的ApoB又可重新聚合成大分子。氧化LDL還具有一系列生物學毒性作用。氧化修飾后的LDL不能經(jīng)LDL受體代謝，由清道夫受體識別、結(jié)合、內(nèi)吞飲入細胞并喪失正常的膽固醇代謝途徑，引起細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積，泡沫樣變。

4．修飾的LDL和氧化修飾的LDL的區(qū)別和聯(lián)系

氧化的LDL是修飾LDL中的一類。修飾的LDL除包括氧化修飾的LDL外，還包括乙酰化LDL及丙二醛、4-羥烯酸直接結(jié)合的LDL，我們稱這些未經(jīng)氧化修飾，而僅經(jīng)一般化學修飾的LDL為衍化的LDL。

衍化的LDL和OxLDL都可以被清道夫受體識別，導致泡沫細胞的形成。在過去的很長一段時間里，我們將一般化學修飾的衍化的LDL和OxLDL混為一談。特別是認為氧化LDL就是MDA-LDL。但實際上，MDA-LDL不同于OxLDL。

用Ca²⁺引發(fā)LDL的氧化修飾，比較氧化修飾的LDL與脂質(zhì)過氧化降解產(chǎn)物MDA修飾的LDL之間的差別。發(fā)現(xiàn)氧化修飾LDL和MDA修飾LDL都產(chǎn)生類似于脂褐質(zhì)的熒光物質(zhì)，都可使LDL上的游離氨基減少，瓊脂糖電泳速度加快，且游離氨基減少量與電泳遷移率增加呈正相關(guān)。但兩類不同的修飾LDL之間也有差異,主要表現(xiàn)在：①對細胞生理功能影響不同。氧化LDL可誘發(fā)細胞毒性作用，影響花生四烯酸的代謝，抑制膽固醇酯化作用等，而一般化學修飾的LDL則無上述效應(yīng)；②氧化修飾消耗LDL內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)，使LDL上的維生素E含量下降，而MDA修飾無上述改變；③氧化修飾涉及脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，LDL中的PUFAs被氧化。MDA對LDL修飾，是直接和ApoB-100結(jié)合成希夫氏堿，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)輕微；④氧化LDL在氧化程度低時，ApoB降解，在氧化程度高時，ApoB又可發(fā)生再聚合。MDA對LDL的修飾，ApoB無降解、聚合反應(yīng)發(fā)生；⑤氧化LDL產(chǎn)生的熒光峰波長為430nm，而MDA修飾LDL的熒光峰波長為460nm。這些差異可能是由于兩類不同的修飾對LDL結(jié)構(gòu)與組成影響不同，提示我們不能簡單地把脂質(zhì)過氧化降解產(chǎn)物修飾的LDL等同于OxLDL。

二、氧化LDL的代謝

OxLDL由清道夫受體識別并進一步代謝。清道夫受體可能是多種受體的總稱，據(jù)報道，除乙�；疞DL的受體外，F(xiàn)cr受體和CD₃₆受體也能介導OxLDL的攝取和降解�，F(xiàn)已證實分離純化的清道夫受體是由3個λkD的亞單位構(gòu)成的糖蛋白，存在于細胞表面，聚丙烯酰胺凝膠電泳測得分子量為2.2×10⁵左右。清道夫受體可以和乙酰化LDL、OxLDL以及諸如次黃嘌呤核苷酸、絲氨酸磷脂等配體結(jié)合。這些物質(zhì)的共同特點為多陰離子化合物。正常LDL受體是通過識別ApoB上由賴氨酸、精氨酸、組氨酸共同構(gòu)成的正電荷區(qū)與LDL結(jié)合的。LDL氧化后，產(chǎn)生的反應(yīng)性醛和LDL的ApoB的賴氨酸殘基的ε氨基結(jié)合，使LDL失去一些正電荷，帶上多量負電荷。這樣OxLDL不能再被LDL受體識別，而被清道夫受體結(jié)合。而且OxLDL攝入速度是天然LDL的3～10倍，并且不受細胞內(nèi)膽固醇含量的應(yīng)答。

巨噬細胞和內(nèi)皮細胞對不同氧化程度的LDL的結(jié)合和降解量是不同的�？偟膩碚f，隨著氧化修飾程度的升高，巨噬細胞和內(nèi)皮細胞對LDL的結(jié)合和降解隨之升高。將LDL與Ca²⁺孵育，LDL經(jīng)氧化后得到瓊脂糖遷移率（Rf)分別為1.33、1.67、2.33的氧化LDL。研究巨噬細胞和內(nèi)皮細胞對這幾種不同氧化程度的LDL的結(jié)合和降解，發(fā)現(xiàn)當LDL修飾程度很低（Rf=1.33)時，OxLDL被巨噬細胞結(jié)合和降解的量接近、甚至低于天然LDL，而當修飾程度高時，被巨噬細胞和內(nèi)皮細胞結(jié)合和降解的量隨之升高，而且明顯高于正常LDL（圖9-8、圖9-9、圖9-10、圖9-11)。

另有報道，正常細胞攝取OxLDL時，LDL受體與清道夫受體起協(xié)同作用。因為氧化程度不同。OxLDL的ApoB上可能殘留多少不等的LDL受體識別位點。用單抗封閉這些位點時，細胞對OxLDL結(jié)合量和降解量下降。

三、OxLDL存在的可能性

（一)動脈粥樣硬化損傷灶存在OxLDL

有學者發(fā)現(xiàn)人、兔動脈粥樣硬化斑塊處分離出的LDL的特性與OxLDL相似，包括電泳速度加快、ApoB降解等。而正常動脈壁處LDL無此特性。

最近，生產(chǎn)出的針對MDA-ApoB的單克隆抗體和MDA-VLDL、MDA-HDL、MDA-白蛋白不發(fā)生交叉反應(yīng)。利用特異性抗原抗體反應(yīng)推測來源于冠心病人的組織標本，發(fā)現(xiàn)在平滑肌細胞、巨噬細胞來源的泡沫細胞中和斑塊核心脂質(zhì)中都有免疫反應(yīng)發(fā)生，而且在人、兔的動脈粥樣硬化病灶區(qū)存在抗OxLDL的自身抗體。

（二)血漿中是否存在OxLDL

抗MDA-LDL自身抗體的滴度可用來預測冠狀動脈粥樣硬化進展。然而這些抗體和蛋白質(zhì)（如蛋白)中MDA-賴氨酸加合物發(fā)生交叉反應(yīng)。目前，尚沒有血漿中存在OxLDL的直接證據(jù)，血漿中存在脂質(zhì)過氧化物和TBARS，它們的含量可以用脂質(zhì)TBARS熒光微量測定法測量。它們可能是氧化LDL的裂解片段。

有學者制備抗OxLDL的單抗，推測血漿中OxLDL的含量，并通過臨床試驗證實冠心病患者血漿中OxLDL濃度高于正常人。然而，由于血漿中是否存在OxLDL有待證實，故這種檢測方法是否能夠用于動脈粥樣硬化的輔助診斷有待證實。

四、OxLDL與動脈粥樣硬化

OxLDL可以通過以下途徑促進動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展。

（一)參與泡沫細胞的形成

在早期的動脈粥樣硬化損傷中，發(fā)現(xiàn)負荷脂質(zhì)的泡沫細胞在動脈內(nèi)膜下集聚。這些泡沫細胞主要來源于攝取OxLDL的單核/巨噬細胞。內(nèi)皮下泡沫細胞的堆積在動脈粥硬化起因中有關(guān)鍵作用。

MarileeLoughecd等認為氧化LDL能抵抗組蛋白酶，從而抵抗溶酶體對OxLDL的降解，在細胞內(nèi)堆積。當然，細胞內(nèi)膽固醇量對清道夫受體的非下降調(diào)節(jié)是細胞泡沫化的主導原因。這些泡沫細胞以大量的二級溶酶體和胞漿脂滴為特點。脂質(zhì)在泡沫細胞中沉積的結(jié)果使得動脈壁從最初的脂肪紋發(fā)展到更復雜的纖維斑塊和粥樣斑塊。這些斑塊最外層富含巨噬細胞來源的泡沫細胞，易于發(fā)生斑塊破裂，引起血栓形成。

（二)促進細胞粘附和巨噬細胞源性泡沫細胞的產(chǎn)生

1.促進單核細胞的粘附和泡沫細胞的產(chǎn)生

單核細胞對動脈內(nèi)皮粘附的增多是實驗動物動脈粥樣硬化早期表現(xiàn)之一。氧化LDL可以通過剌激細胞間粘附分子-1（ICAM-1)表達，使單核細胞，中性白細胞和淋巴細胞與內(nèi)皮結(jié)合的數(shù)量增多，而且這種結(jié)合表現(xiàn)出高親和力。還可以剌激內(nèi)gydjdsj.org.cn/rencai/皮白細胞粘附分子-1（VCAM-Ⅰ)的表達，導致單核細胞的粘附移行。而且，OxLDL還能促使內(nèi)皮細胞和血小板產(chǎn)生一種分子量為140kD_a的顆粒膜蛋白（GMP140)。這種顆粒膜蛋白能在細胞激活的基礎(chǔ)上快速翻譯到細胞膜上，結(jié)合中性白細胞和單核細胞。微氧化的LDL，不能被清道夫受體識別，但它已能剌激特定的單核細胞粘附分子的表達。

單核細胞粘附于內(nèi)皮后移行入內(nèi)膜。內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞和巨噬細胞分泌特定趨化劑，如單核細胞趨化劑1（MCP-1)，MCP-1的合成受OxLDL的剌激。

圖9-8 單核細胞源泡沫細胞的產(chǎn)生

ECAM-1，內(nèi)皮白細胞粘附分子-1　1CAM-1，細胞間粘附分子-1

VCAM-1，血管細胞粘附分子-1MCP-1，單核細胞趨化蛋白-1

M-CSF，單核細胞集落剌激因子　GM-CSF，粒細胞-單核細胞集落剌激因子

氧化LDL剌激內(nèi)皮細胞分泌粘附分子（ECAM-1、ICAM-1、VCAM-1)，內(nèi)膜單核細胞的增生受特定集落刺激因子（GM-CSF、M-CSF)的誘導。繼而單核細胞分化為巨噬細胞并分泌特異的針對單核細胞的趨化劑（MCP-1)。進而，巨噬細胞通過清道夫受體聚積OxLDL，轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽�細胞�?/p>

OxLDL激活內(nèi)皮細胞，促使趨化因子、粘附分子、粒細胞一單核細胞集落剌激因子（GMCSF)和單核細胞集落剌激因子（M-CSF)分泌。所有這一切都會剌激巨噬細胞的增生和分化。M-CSF誘導巨噬細胞表面清道夫受體的表達，使OxLDL攝取增多，巨噬細胞泡沫化（圖9-8)。

2．促進中性gydjdsj.org.cn/shiti/白細胞粘附

研究發(fā)現(xiàn)注射OxLDL，可在體外誘導內(nèi)皮結(jié)合白細胞，Lehr等人進一步證實這一作用涉及血小板活性因子受體和CD_11b/CD₁₈粘附受體復合物。

（三)誘導平滑肌細胞增生、移行，產(chǎn)生平滑肌細胞源性泡沫細胞

OxLDL通過誘導巨噬細胞和平滑肌細胞產(chǎn)生血小板源生長因子（PDGF)，促進平滑肌細胞移行。通過誘導內(nèi)皮細胞產(chǎn)生堿性成纖維細胞生長因子（bFGF)，促進平滑肌細胞增生。最終，OxLDL誘導平滑肌細胞表面清道夫受體的表達，導致平滑肌細胞內(nèi)吞OxLDL，繼而產(chǎn)生平滑肌源性泡沫細胞（圖9-9)。

圖9-9 平滑肌細胞源泡沫細胞的產(chǎn)生

bFGF，堿性成纖維細胞生長因子

PDGF，血小板源生長因子

OxLDL引起平滑肌細胞從中膜移行入內(nèi)膜，結(jié)果內(nèi)膜增厚。激活平滑肌細胞和巨噬細胞分泌PDGF和bFGF，它們可誘導平滑肌細胞增生和移行。而且bFGF誘導清道夫受體表達。通過這些受體，平滑肌細胞聚積OxLDL，轉(zhuǎn)變成泡沫細胞。

（四)促進血小板粘附、聚集、血栓形成

OxLDL抑制內(nèi)皮細胞衍生的舒張因子（EDRF)或NO的合成，損傷動脈壁正常的舒張功能。而且OxLDL中的溶血卵磷脂誘導合成內(nèi)皮細胞衍生的收縮因子（EDCF)，誘使血管收縮。

氧化LDL可以促使血小板聚集、增強花生四烯酸代謝及血栓素B₂（TXB₂)的產(chǎn)生，減少膜脂流動性。OxLDL抑制前列腺素I₂合成酶，使前列腺素I₂（PGI₂)合成減少，激活血小板環(huán)氧化酶，使血栓素A₂（TXA₂)產(chǎn)生增加，破壞了PGI₂/TXA₂平衡，促進血小板聚集，引起血管痙攣和血栓形成。

（五)損傷內(nèi)皮細胞

內(nèi)皮細胞的損傷和功能改變是動脈粥樣硬化發(fā)生的基礎(chǔ)。內(nèi)皮細胞的損傷在動脈粥樣硬化的發(fā)病機理中作為起始機制，被認為具有重要作用。多種研究提示內(nèi)皮細胞對自由基和脂質(zhì)過氧化作用非常敏感。

LDL氧化過程中產(chǎn)生的脂氫過氧化物可以直接損傷內(nèi)皮細胞。OxLDL可使內(nèi)皮細胞對LDL的通透性增高，胞漿發(fā)生空泡變性，漿膜皺縮，甚至可使細胞最終壞死。內(nèi)皮細胞受損又使內(nèi)皮細胞保護劑PGI₂的合成進一步減少，促進中性粒細胞對內(nèi)皮的粘著及呼吸爆發(fā)，促進血小板在內(nèi)皮聚集、釋放O₂^-，進一步加重內(nèi)皮損傷。

OxLDL對細胞的毒性無需受體介導。細胞對OxLDL的易感性取決于細胞分裂所處的細胞周期和細胞內(nèi)谷胱甘肽的含量。丙丁酚可轉(zhuǎn)移并滲入細胞膜作為一種捕捉自由基的抗氧化劑對抗氧化壓力。細胞和OxLDL孵育會使基質(zhì)中TBARS增多。這以上二點似乎提示內(nèi)皮細胞膜自由基反應(yīng)特別是脂質(zhì)過氧化，與OxLDL激發(fā)的內(nèi)皮細胞損傷有關(guān)。內(nèi)皮細胞膜脂質(zhì)過氧化降低膜脂質(zhì)流動性，增加膜對離子滲透性，抑制膜結(jié)合酶活性。OxLDL怎樣誘導細胞膜脂質(zhì)過氧化，還不清楚。

（六)產(chǎn)生抗OxLDL的自身抗體

在兔和人的血清中都發(fā)現(xiàn)了抗OxLDL的自身抗體，且抗體的滴度和心血管動脈粥樣硬化進程密切相關(guān)，表明免疫機制在動脈粥樣硬化發(fā)病機理中起了作用。

最近還發(fā)現(xiàn)粥樣斑塊區(qū)的炎性浸潤物包含T淋巴細胞和B淋巴細胞。這些T淋巴細胞主要是由局部抗原激活的淋巴細胞。斑塊區(qū)沉積的膽固醇還能通過誘導人類主要組織相容性Ⅱ類抗原表達，加強巨噬細胞呈遞抗原的功能。

OxLDL通過以上多種途徑在動脈粥樣硬化的起始和進展中發(fā)揮了舉足輕重的作用。

既然OxLDL和動脈粥樣硬化的關(guān)系如此密切，那么抗LDL的氧化修飾就成為阻斷動脈粥樣硬化進程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。有可靠的證據(jù)表明LDL的氧化修飾，只有在LDL內(nèi)源性、親脂性抗氧化劑消耗殆盡后才會發(fā)生，其中維生素E作為第一線抗氧化劑，β-胡羅卜素作為抗LDL氧化的最后一層屏障。如果的確是這樣，就可以解釋攝食的抗氧化劑的血漿水平為什么和心血管疾病的危險性呈負相關(guān)。流行病學研究也進一步表明血漿中維生素E水平高的人群，心血管疾病患病的危險性低。這些研究給動脈粥樣硬化的預防和治療提供了新的思路。