免疫學(xué)和免疫學(xué)檢驗(yàn):第一節(jié)　有關(guān)熒光的基本知識(shí)

一、熒光現(xiàn)象

（一)熒光的產(chǎn)生

一此化學(xué)物質(zhì)能從外界吸收并儲(chǔ)存能量（如光能、化學(xué)能等)而進(jìn)入激發(fā)態(tài)，當(dāng)其從激發(fā)態(tài)再回復(fù)到基態(tài)時(shí)，過剩的能量可以電磁輻射的形式放射（即發(fā)光)。

熒光發(fā)射的特點(diǎn)是：可產(chǎn)生熒光的分子或原子在接受能量后即刻引起發(fā)光；而一旦停止供能，發(fā)光（熒光)現(xiàn)象也隨之在瞬間gydjdsj.org.cn/wszg/內(nèi)消失。

可以引起發(fā)熒光的能量種類很多，由光激發(fā)所引起的熒光稱為致熒光。由化學(xué)應(yīng)所引起的稱為化學(xué)熒光，由X線或陰極射線引起的分別稱為X線熒光或陰極射線熒光。熒光免疫技術(shù)一般應(yīng)用致熒光物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。

（二)熒光效率

熒光分子不會(huì)將全部吸收的光能都轉(zhuǎn)變成熒光，總或多或少地以其他形式釋放。熒光效率是指熒光分子將吸收的光能轉(zhuǎn)變成熒光的百分率，與發(fā)射熒光光量子的數(shù)值成正比。

熒光效率＝發(fā)射熒光的光量分子數(shù)（熒光強(qiáng)度)／吸收光的光量子數(shù)（激發(fā)光強(qiáng)度)

發(fā)射熒光的光量子數(shù)亦即熒光強(qiáng)度，除受激發(fā)光強(qiáng)度影響外，也與激發(fā)光的波長(zhǎng)有關(guān)。各個(gè)熒光分子有其特定的吸收光譜和發(fā)射光譜（熒光光譜)，即在某一特定波長(zhǎng)處有最大吸收峰和最大發(fā)射峰。選擇激發(fā)光波長(zhǎng)量接近于熒光分子的最大吸收峰波長(zhǎng)，且測(cè)定光波量接近于最大發(fā)射光波峰時(shí)，得到的熒光強(qiáng)度也最大。

（三)熒光的猝滅

熒光分子的輻射能力在受到激發(fā)光較長(zhǎng)時(shí)間的照射后會(huì)減弱甚至猝滅，這是由于激發(fā)態(tài)分子的電子不能回復(fù)到基態(tài)，所吸收的能量無法以熒光的形式發(fā)射。一些化合物有天然的熒光猝滅作用而被用作猝滅劑，以消除不需用的熒光。因此熒光物質(zhì)的保存應(yīng)注意避免光（特別是紫外光)的直接照射和與其他化合物的接觸。在熒光抗體技術(shù)中常用一些非熒的色素物質(zhì)如亞甲藍(lán)、堿性復(fù)紅。伊文思藍(lán)或低濃度的過錳酸鉀、碘溶液等對(duì)標(biāo)本進(jìn)行得當(dāng)復(fù)染，以減弱非特異性熒光本質(zhì)，使特異熒光更突出顯示。

二、熒光物質(zhì)

（一)熒光色素

許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象，但并非都可用作熒光色素。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機(jī)化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料。常用的熒光色素有：

1．異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC)為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4，最大吸收光波長(zhǎng)為490495nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)520530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，結(jié)構(gòu)式如下：

有兩種同分異結(jié)構(gòu)，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好，在冷暗干燥處可保存多年，是應(yīng)用最廣泛的熒光素。其主要優(yōu)點(diǎn)是：①人眼對(duì)黃綠色較為敏感，②通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。

2．四乙基羅丹明（rhodamine，RIB200)為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性質(zhì)穩(wěn)定，可長(zhǎng)期保存。結(jié)構(gòu)式如下：

最大吸收光波長(zhǎng)為570nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)為595～600nm，呈橘紅色熒光。

3．四甲基異硫氰酸羅丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC)結(jié)構(gòu)式如下：

最大吸引光波長(zhǎng)為550nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)為620nm，呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對(duì)比鮮明，可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧�。其異硫氰基可與蛋白質(zhì)結(jié)合，但熒光效率較低。

（二)其他熒光物質(zhì)

1．酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無熒光效應(yīng)，一旦經(jīng)酶作用便形成具有強(qiáng)熒光的物質(zhì)。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮，后者可發(fā)出熒光，激發(fā)光波長(zhǎng)為360nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為450nm。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對(duì)羥基苯乙酸等。

2．鑭系螯合物某些3價(jià)稀土鑭系元素如銪（Eu³⁺)、鋱（Tb³⁺)、鈰（Ce³⁺)等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光，其中以Eu³⁺應(yīng)用最廣。Eu³⁺螯合物gydjdsj.org.cn/zhicheng/的激發(fā)光波長(zhǎng)范圍寬，發(fā)射光波長(zhǎng)范圍窄，熒光衰變時(shí)間長(zhǎng)，最適合用于分辨熒光免疫測(cè)定。