臨床生物化學:第二節(jié)　載脂蛋白

脂蛋白中的蛋白部分稱為載脂蛋白（apolipoprotein/apoprotein，Apo)。載脂蛋白在脂蛋白代謝中具有重要的生理功能。Apo構成并穩(wěn)定脂蛋白的結構，修飾并影響與脂蛋白代謝有關的酶的活性。作為脂蛋白受體的配體，參與脂蛋白與細胞表面脂蛋白受體的結合及其代謝過程。

一、載脂蛋白組成與結構特點及生理功用

Apo種類很多，一般分為5-7類，其氨基酸序列大多數已闡明，Apo種類的命名是按1972年Alaupovic建議的命名方法，用英文字母順序編碼，即ABC順，每一類還有亞類。

（一)載脂蛋白A族

ApoA可分為ApoAⅠ，AⅡ,AⅣ。ApoAⅠ和AⅡ大部分分布在HDL中，是HDL的主要載脂蛋白。

1.ApoAⅠApoAⅠ是ApoA族最多的一種組份，先后從人HDL中分離純化得到ApoAⅠ，并闡明了ApoAⅠ的氨基酸序列，也預測了其二級結構的要點。人成熟的ApoAⅠ由243個氨基酸殘基組成，是單一多肽鏈，分子量為28.3ku。人及大鼠、猴、兔、牛、鴨、樹鼷等動物的ApoAⅠ已分離純化。人和其他種屬的ApoAⅠ的氨基末端為Asp，羧基末端為Gln，其分子中不含半胱氨酸和異亮氨酸。經等電點聚焦電泳證實，人和動物的ApoAⅠ都是不均一的，有10種不同的亞組份，至少有6種多態(tài)性。

目前所知，ApoAⅠ的氨基酸殘基的排列有其自身的特征：①極性氨基酸殘基含量較多，并以1，2或1，4相反離子對的形式排列www.gydjdsj.org.cn，即Glu-Arg、Glu-Lys或Asp=lys、Asp-Arg。②疏水氨基酸殘基一對對地出現在1，2或1，4反離子對的附近，因此很容易形成特有的雙性螺旋二級結構。極性與非極性氨基酸殘基排列的方式是載脂蛋白的一個共性。由疏水氨基酸殘基組成螺旋的非極性面，由帶電荷親水的氨基酸殘基組成螺旋極性面，故稱為雙性螺旋。與一般蛋白質的α-螺旋不同，這種雙性螺旋既有親脂的一面又有親水的一面。ApoAⅠ富含雙性螺旋結構，對于維持其正常的生理功能是非常重要的。

ApoAⅠ主要存在于HDL中，在HDL₃中ApoAⅠ占載脂蛋白的65％，在HDL₂中ApoAⅠ占載脂蛋白的62％，在CM、VLDL和LDL中也有少量存在。血漿中呈現β遷移率的一種β-HDL，其內80％為ApoAⅠ。

Ⅰ的生理功能有：①組成載脂蛋白并維持其結構的穩(wěn)定性與完整性。實驗表明，純化的ApoAⅠ在水溶液中可以自發(fā)地和脂類結合。用CNBr法將ApoAⅠ裂解成四個肽段，發(fā)現僅有羧基末端的肽段可自發(fā)和磷脂結合。后來進一步確認這一段是ApoAⅠ224-242段，這一段既可維持雙性螺旋的結構，又可以維持和脂質結合所具備的疏水性。②ApoAⅠ可以激活卵磷脂膽固醇酰基轉移酶（LCAT)的活性。已經證實，ApoAⅠ是通過激活LCAT，再催化膽固醇酯化。ApoAⅠ肽段Ⅲ（肽段116-151)是激活作用的中心。③ApoAⅠ可作為HDL受體的配體，含ApoAⅠ脂蛋白可以和轉鐵蛋白及銅藍蛋白形成大分子復合物以運輸鐵和銅離子。

Ⅰ由肝和小腸合成，血漿中生物半壽期為45天。

2.ApoAⅡApoAⅡ是HDL中第二種含量多的載脂蛋白，在HDL₂中占載脂蛋白的15％，在HDL₃中占載脂蛋白25％，在CM中占載脂蛋白的7％-10％，VLDL中也存在少量。到1985年，ApoAⅡ蛋白質的氨基酸序列，cDNA序列及基因序列均已闡明。ApoAⅡ是由兩條多肽鏈的77個氨基酸殘基組成。ApoAⅡ在不加還原劑的SDS-PAGE中測出分子量是17ku，在人血漿中以二聚體形式存在。ApoAⅡ的單體分子量為8.7ku。ApoAⅡ蛋白的C端氨基酸殘基為谷氨酸，N端為吡咯烷酮酸，缺乏組氨酸、精氨酸及色氨酸。ApoAⅡ有多態(tài)性存在。

ApoAⅡ生理功能是：①維持HDL結構，ApoAⅡ肽段12-31和肽段50-77具有與磷脂結合的能力。經二級結構分析認為，殘基17-30和51-62形成的雙性螺旋結構是人ApoAⅡ與脂質結合的分子基礎。②激活肝脂酶，用以水解CM和VLDL中的TG和PL。還有報道，ApoAⅡ可抑制LCAT活性。

ApoAⅡ由肝和小腸合成。人血漿中的ApoAⅡ生物半壽期為4.4天。

3.ApoAⅣ最先從大鼠HDL和CM中發(fā)現載脂蛋白AⅣ，以后證實人血漿中也有ApoAⅣ存在，主要分布于密度大于1.211g/ml部分。成熟ApoAⅣ由376個氨基酸殘基組成。經SDS-PAGE確認大鼠和人ApoAⅣ分子量為44-46ku。人和大鼠氨基酸組成相似，是一種糖蛋白，含有6％的碳水化合物，其中甘露醇占1.8％，半乳糖占1.55％，N-乙酰葡萄糖胺占1.55％，唾液酸占1.1％。ApoAⅣ有多態(tài)性存在，生物半壽期為10小時。

ApoAⅣ生理功能目前尚不完全清楚，據推測ApoAⅣ在膽固醇逆向轉運過程中起著重要作用。體外的ApoAⅣ可以促進LCAT的膽固醇酯化反應，并認為是LCAT的激活劑。ApoAⅣ由肝和小腸合成，并有五種多態(tài)型。

（二)Apob族

體外實驗表明，ApoB是難溶于水的蛋白質。目前所知，ApoB族可分為兩個亞類，即ApoB₄₈和ApoB₁₀₀。ApoB主要成分是B₁₀₀，其次為B₄₈，其它形式的如ApoB₇₅、ApoB₄₁、ApoB₃₆等均為ApoB₁₀₀的不同降解產物。

1.ApoB₁₀₀ApoB是單鏈糖蛋白，分子量為51ku，主要在肝，少數在小腸合成。ApoB₁₀₀由4536個氨基酸殘基組成。包括27個（或24)氨基酸信號肽和4536個氨基酸殘基的成熟單體蛋白。1986年ApoB₁₀₀的全部氨基酸殘基排列順序及結構已經闡明。當年已測出ApoB₁₀₀的cDNA序列，ApoB₁₀₀分子中含有25個Cys殘基。其中有11個Cys殘基集中分布在前面500氨基酸組成區(qū)域，形成鏈內二硫鍵，所以N端高度交聯成典型球形結構。Cys殘基通過硫酯鍵與軟脂酸、硬脂酸相結合，使ApoB牢固地連接著脂質成分。ApoB₁₀₀中，對脂類結合十分必要的區(qū)域結構在203-2506和4002-4527氨基酸殘基之間。兩個結構區(qū)域重復出現兩性親脂α-螺旋區(qū)段；另有一種結合脂質的重要結構是含疏水和親水性氨基酸交替排列的兩性親脂β-折疊結構。這種結構分布在整個分子序列中，但集中于四個富含脯氨酸區(qū)，這種富含脯氨酸的重復序列是ApoB所特有的，使ApoB能夠將磷脂側鏈深埋其間并使之緊密結合。由于ApoB的兩性α-螺旋和富含脯氨酸的疏水肽以及可被脂�；�的Cys殘基形成的特殊結構，在VLDL和LDL從分泌到被清除的整個過程中，使α-螺旋能夠與單層極性脂牢固地結合，從而使其不在脂蛋白分子間轉換，這是與其他載脂蛋白不同之處。

ApoB₁₀₀的生理功能有：①合成裝配和分泌富含甘油三酯的VLDL；②是LDL的結構蛋白。③LDL受體的配體，并可調節(jié)LDL從血漿中的清除速率。

2.ApoB₄₈ApoB₄₈因分子量是ApoB₁₀₀的48％而得名。存在于CM中，不與其他脂蛋白分子交換。ApoB₄₈在小腸合成，是組裝CM所必需的載脂蛋白。小腸細胞分泌CM后進入淋巴液，并通過胸導管再進入血液循環(huán)，再分布到毛細血管的內皮細胞，主要是骨骼肌體和脂肪組織的內皮細胞，脂肪酶可水解CM中甘油三酯的80％-90％，剩下的脂蛋白顆粒則稱為CM殘粒，尓后送到肝，被肝脂酶進一步代謝，最后被能夠識別ApoE的殘粒受體攝取。該殘粒受體是LDL受體，還是與LDL受體相關的蛋白或其他蛋白質，目前尚不清楚。

人血漿中ApoB₄₈生物半壽期僅5-10分鐘，分解速度很快，血漿中的濃度很低，約相當于ApoB₁₀₀的0.1％。經SDS-PAGE電泳染色在VLDL組分中可檢出痕量的ApoB₄₈。進食豐富的脂肪后，ApoB₄₈/ApoB₁₀₀比值明顯增加。

（三)ApoC族

ApoC是目前所知載脂蛋白中分子量最小的一類。最先從VLDL中分離出一種含有少量磷脂的低分子量載脂蛋白，并命名為載脂蛋白C。此后雙在HDL中發(fā)現有ApoC，并進一步確認ApoC有三種亞型，即ApocⅠ、Ⅱ、Ⅲ。

Apoc是由57個氨基酸殘基組成的單一多肽鏈，其序列已測出，不含半胱氨酸、組氨酸和酪氨酸。分子量為6625u。人ApoCⅠ二級結構中有55％α-螺旋結構，極易與磷脂結合，它是LCAT的激活劑。

ApoCⅡ是由79個氨基酸殘基組成單一多肽鏈，氨基酸順序已測出，分子量為9110u,有兩種多態(tài)型，pⅠ分別為4.86和4.69。不含半胱氨酸和絲氨酸，其二級結構的α-螺旋約占23％。ApoCⅡ可激活多種來源的脂蛋白脂肪酶（LPL)，其結構中第55-78位氨基酸殘基是維持其對LPL激活作用的最短的必須區(qū)域。羧基端43-50位氨基酸殘基為α-螺旋結構的脂質結合區(qū)。

ApoCⅢ由79個氨基酸殘基組成單一多肽鏈，由于第74位蘇氨酸殘基所帶唾液酸個數不同，又可分為ApoCⅢ₀、CⅢ₁、CⅢ₂三個亞類，也是其多態(tài)性，等電點分別為5.02，4.82和4.62。ApoCⅢ氨基酸序列已測出，分子量為8764u，其二級結構在不同狀態(tài)下，α-螺旋約占22％-54％不等。ApoCⅢ的α-螺旋結構極易與磷脂結合。

ApoC族生理功能有：①同磷脂相互作用，維持脂蛋白結構：在溶液中呈特殊的立體雙性離子，帶負電荷的酸性氨基酸與磷脂帶正電荷的基團作用，具有很強的磷脂結合活性。由于與磷脂的相互作用，使ApoC族的α-螺旋結構增加，而磷脂的單個酯酰鏈的運動則受到限制，從而影響磷脂從凝膠態(tài)到液晶態(tài)的轉變，兩者作用的結果，從而固系了脂蛋白的結構；②對酯酶有激活作用，HDL的磷脂在流動性增加時，ApoCⅠ通過HDL脂層表面后促進了LCAT的催化作用；③ApoCⅡ可以激活LPL，其激活機制可能是：LPL通常與外周循環(huán)肝素樣分子結合并附著于血管內皮上，當LPL接觸CM或VLDL時，LPL便同脂蛋白顆粒表面的磷脂發(fā)生作用，進而結合于脂蛋白顆粒上，其內的ApoCⅡ與LPL發(fā)生作用，改變LPL的空間結構，進而催化水解甘油三酯。

Apoc主要由肝合成，小腸也合成少量。

（四)ApoE

ApoE是一種富含精氨酸的堿性蛋白，人AppE由299個氨基酸殘基組成，分子量為34.145ku，含32個Arg和12個Lys，存在于血漿CM、VLDL及其殘粒中，β-VLDL中含ApoE量高于VLDL，一部分ApoE在血液中與ApoAⅡ形成復合體。已測出ApoE的蛋白質一級結構，建立ApoE和cDNA序列，并確認ApoE有3個等位基因異構體以及基因在染色體上的定位。據推算和測定，在溶液中ApoE有62％的α-螺旋、9％的β-片層、11％的β-轉角和18％的無規(guī)則線團。ApoE分子可以被凝血酶水解為N-端和C-端兩個區(qū)域，N-端區(qū)（1-191)為22ku的可溶性球蛋白，此區(qū)域較穩(wěn)定；C-端區(qū)（216-299)分子量為10ku，螺旋程度很高，不穩(wěn)定，是與脂蛋白的結合區(qū)，ApoE主要由肝臟合成，近年來發(fā)現腦、腎、骨骼、腎上腺及巨噬細胞也能合成ApoE。

ApoE生理功能有：①是LDL受體的配體，也是肝細胞CM殘粒受體的配體，它與脂蛋白代謝密切相關；②ApoE具有多態(tài)性，多態(tài)性與個體血脂水平及動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展密切相關。

（五)Apo(a)

早期測定脂蛋白（a)[LP(a)]在人群分布率為30％。目前采用更靈敏的方法發(fā)現幾乎存在于所有人群中，僅是血漿深度差異很大，波動在0-1000mg/L的范圍。1987年克隆了人Apo(a)的基因序列，并推導出氨基酸序列，提示Apo(a)的分子結構與纖溶酶原極為相似。Apo(a)含有一個疏水信號序列，37個Kringle-4拷貝、1個Kringle-5及1個胰蛋白酶樣區(qū)。第36個Kringle-4含有一個額外未配對半胱氨酸，推測此處可能是Apo(a)以二硫鍵與ApoB結合的部位。經胰蛋白酶限制性水解Apo(a)發(fā)現，Apo(a)中的Krtingle-4有75％-85%的氨基酸與纖溶酶原的第391-472個氨基相同，有共同的抗原簇，兩者表現有交叉反應。纖溶酶原（PG)是一種絲氨酸蛋白酶原，含有791個氨酸殘基，結構中含有5個富含半胱氨酸的“Kringle”樣結構，即Kringle1-5，在Kringle-5的后面為一絲氨酸蛋白酶區(qū)。PG與Apo(a)結構相似，如圖4-3所示。

圖4－3 載脂蛋白（a)結構示意圖

A:KringleB：纖維蛋白溶酶原C：Apo（a)

Kringle結構是三對二硫鍵組成的三套環(huán)形結構，含有78-82個氨基酸殘基，因其序列的書寫形式酷似一種丹麥面糕而得名。在其第1與第6、第2與第4、第3與第5半胱氨酸上，連成三個二硫鍵。這種結構也出現在前凝血酶、尿激酶、鏈激酶和纖溶酶原激活劑（t-PA)的組份中。由于Apo(a)分子中的Kringle-4數目可在15-27之間變化，從而導致Apo(a)有多種不同的異構體。

Apo(a)結構中有一蛋白酶區(qū)，推測其功能可能是一種酶。在分子中相當于PG蛋白酶的絲氨酸被精氨酸代替，可使其喪失酶的功能。由于Kringle結構與PG相似，推測Apo(a)可能結合到象PG受體或纖維蛋白那樣的大分子上，再加上LP(a)顆粒攜帶的膽固醇結合到血管損傷部位，因此它不僅促進動脈粥樣硬化形成，也阻礙血管內凝血塊的溶解。

二、載脂蛋白的基因結構及表型

（一)基因多態(tài)性概念

各種生物都能通過生殖產生子代，子代和親代之間，不論在形態(tài)構造或生理功能的特點上都很相似，這種現象稱為遺傳（heredity)。但是，親代和子代之間，子代的各個體之間不會完全相同，總會有所差異，這種現象叫變異（variation)。遺傳和變異是生命的特征。遺傳和變異的現象是多樣而復雜的，正因為如此，才導致生物界的多種多樣性，生物體所具有的遺傳性狀稱為表型或表現型（phernotype)。生物體所具有的特異基因成分稱為基因型（genotype)。表型是基因型與環(huán)境因素相互作用的結果。遺傳物質是相對穩(wěn)定的，但是又是可變的，遺傳物質的變化以及由其所引起表型的改變，稱為突變（mutation)。遺傳物質突變包括染色體畸變和基因突變�；�因突變是染色體中某一點上發(fā)生化學改變，所以又稱為點突變（pointmutation)�；�因結構和遺傳表型的研究是深入了解脂蛋白代謝缺陷癥的分子生物學基礎，逆向遺傳學方法（reversegeneticapproach)則使其有可能在蛋白質水平系統地分析結構和功能的關系�，F已采用一個特定的cDNA探針從基因文庫中篩選所需要的基因進行cDNA克隆，測定其核苷酸序列，然后從核苷酸序列推斷蛋白質氨基酸序列。目前，已分離出許多與動脈粥樣硬化有關的脂蛋白的cDNA克隆，并將其蛋白質一級結構的氨基酸排列順序和基因的核苷酸順序測出。現已查明，ApoAⅠ、AⅣ、E、B、CⅡ和(a)都存在著異構體，也就是說存在著各種不同的表型或基因型，并可分別從蛋白質水平和核酸水平進行分型�，F分別介紹幾種主要載脂蛋白的基因結構。

（二)載脂蛋白基因結構特點

人血漿中載脂蛋白的結構及功能，經過近十年的深入研究，已了解得較為清楚。大部分載脂蛋白的基因和cDNA都已得到分離和確定，其核苷酸順序也進行了測定。除ApoAⅣ，B、(a)外，它們的共同特點是含有三個內含子（intron)和四個外顯子（exon)，其內含子插入外顯子的位置大致相同，基本上按照生理功能的不同，將其加以分隔。第一個內含子把5′-末端的非翻譯區(qū)和翻譯區(qū)分開；第二個內含子把信號肽編碼（singnalpeptide)和功能蛋白編碼區(qū)分開；第三個內含子則把原肽編碼區(qū)和成熟肽編碼區(qū)分開。這些基因的第一、二、三外顯子的核苷酸數量也相差無幾，第四個外顯子核苷酸數量不同而導致各種載脂蛋白基因長度不同。從生物進化角度考慮，上述載脂蛋白基因結構相似性，提示可能來源于一個共同的祖先，即ApoCⅠ基因。ApoAⅣ與其他載脂蛋白基因結構不同，它只含有三個外顯子。載脂蛋白基因結構的另一特點是幾個基因相接很近，定位于同一染色體的一個位點上或附近，呈緊密連鎖狀態(tài)。如ApoAⅠ、CⅢ和AⅣ基因位于第11號染色體長臂2區(qū)，形成一個約15kb的基因簇。還有一個緊密連鎖的基因簇是ApoE、CⅠ和CⅡ基因，同位于第19號染色體長臂3區(qū)，見圖4-4。

ApoA-Ⅱ基因定位于第1號染色體長臂2區(qū)，ApoB基因定位于第2號染色體短臂2區(qū)，Apo(a)基因定位于第6號染色體長臂2區(qū)。

（三)載脂蛋白基因結構

1.ApoAⅠApoAⅠ基因長1863bp，含有三個內含子，第一個內含子位于5′端非翻譯區(qū)；第二個內含子位于翻譯區(qū)的AⅠ前肽區(qū)內；第三個內含子插入翻譯成熟AⅠ第43氨基酸殘基處。ApoAⅠ基因含有四個外顯子，分布于ApoAⅠ基因的不同區(qū)域，ApoAⅠ基因與ApoCⅢ、AⅣ基因相連成簇，CⅢ基因居中，轉錄方向與AⅠ和AⅣ基因相反。位于AⅠ和CⅢ基因共同3′區(qū)的DNA序列，可能參與對AⅠ基因的轉錄調控。

圖4-4 人載脂蛋白AⅠ、AⅡ、AⅣ、B₁₀₀、

CⅡ、CⅢ和E基因結構示意圖

粗線代表外顯子，粗線之間的細線代表內含子，粗線上緣數字

代表該段核苷酸數目

2.ApoBApoB族位于2號染色體P²³→P^ter區(qū)，是由非翻譯區(qū)、編碼區(qū)、TAA終止密碼子和一個3′端的非翻譯區(qū)組成。ApoB₁₀₀基因全長43kb，含29個外顯子和28個內含子見圖4-4，其中第26和第29兩個外顯子特別長，分別含有7552和1905bp，外顯子2最短，僅39bp（從211-249)。內含子則以第27個為最短（107bp)。人群中至少有14種不同的3′端高變異等位基因區(qū)，75％的人群在此區(qū)是不均一的。

ApoB₄₈和ApoB₁₀₀除了在結構上有關外，ApoB₄₈的形成機制目前尚無完全一致的看法，主要認為有合成ApoB₄₈的基因存在。1987年被發(fā)現ApoB₄₈是由ApoB₁₀₀通過一種新的機制涉及到mRNA的編輯而www.gydjdsj.org.cn/Article/產生的。在測定從人小腸基因庫分離的ApoBcDNA的序列時發(fā)現，小腸ApoBcDNA的第6666個核苷酸為T，而從肝分離的ApoBcDNA克隆在此位置為C。將T替換C則6666處產生一終止編碼（TAA)，TAA替換CAA編碼使ApoB₁₀₀的2153位氨基酸應為Gln，預示血漿中存在的ApoB₄₈應是相當于ApoB₁₀₀的2153氨基末端為Gln。這一預測后來得到實驗證實，并發(fā)現核苷酸上6666的替換C→T只發(fā)生在小腸的mRNA上，而不發(fā)生在小腸基因組（genomic)DNA上，因此這是轉錄以后的一種特殊形成的編輯小腸mRNA的結果．

3.ApoE人ApoE基因位于19號染色體長臂3區(qū)，含有四個外顯子和三個內含子。

1975年首先觀察到ApoE的多態(tài)性，利用等電聚焦電泳和SDS-PAGE可以確認ApoE的多態(tài)性。實驗表明，ApoE有三種異構體（isoform)即E₂、E₃和E₄。有的人只含有一種主要異構體即純合子，有的人可含二種主要異構體為雜合子。由此可見，人群中可有六種不同的表現。根據ApoE表型提出ApoE基因模型認為，ApoE的合成是由位于一個基因位點上的三個等位基因所控制，即E₂、E₃和E₄，每一個等位基因對應于一個主要異構體，產生三種純合子（E2/2，E3/3，E4/4)和三種雜合子（E2/3，E2/4，E3/4)共六種常見表型，另外，還有極少見的異構體。一般認為，次要異構體是由主要異構體翻譯后，經唾液酸糖化修飾后轉變而來。ApoE3/3型又稱野生型。ApoE的基因序列的112位和158位兩種氨基酸殘基即精氨酸（Arg)和半胱氨酸（Cys)的交換決定了異構體的種類。ApoE4在這兩個位置上都是Arg；E2都是Cys；112和158位是Arg者為ApoE3異構體。自然人群中，基因頻率（3)分布最高，ApoE3/3表型分布約70％，見圖4-5。

4.ApoC族ApoCⅡ基因有3347bp，含有4個外顯子和3個內含子。ApoCⅡ的羧基末端氨基酸序列是激活脂蛋白脂肪酶的活性功能區(qū)域。ApoCⅢ基因含有3133bp，有4個外顯子和3個內含子。

圖4-5 人ApoE三種主要異構體的氨基酸殘基及基因密碼的改變位置

5.Apo(a)運用cDNA探針進行染色體定位研究時發(fā)現，Apo(a)的基因位點在人第6號染色體長臂2區(qū)6-7帶間，與血纖溶酶原（PLG)的基因位點有部分重疊。測定PLG基因跨距為525kb，由18個內含子與19個外顯子組成，5個Kringle結構由各自兩個外顯子編碼。Apo(a)cDNA分析表明，Apo(a)與PLG的基因有很多相似之處。

通過家系研究，目前已發(fā)現Apo(a)基因位點中至少有26個等位基因與多態(tài)性有關。這些等位基因至少表達有34種Apo(a)異構體。