七 高效液相色譜法
高效液相色譜（HPLC)又叫高壓、高速、近代液相柱色譜，但常叫做高效液相色譜。它是20世紀(jì)60年代中期才建立的一個高效快速分離化合物的方法，廣泛地用在生物大分子的分離和純化方面。在分離生物大分子時HPLC與經(jīng)典的柱液相色譜比較具有以下幾個優(yōu)點�、俜直媛矢撸阂桓L10cm的柱子可以分離十幾種以上的物質(zhì)；②速度快：物質(zhì)的分離與純化一般在1h內(nèi)就可以完成，甚至只需要幾分鐘時間，其流速一般為1～10ml／min或更高；③重復(fù)性好：HPLC在分析生物大分子時結(jié)果誤差小于５％；④適用面廣，靈活性強：幾乎所有的生物大分子根據(jù)它們的性質(zhì)差別（等電點、疏水性、相對分子質(zhì)量、電荷分布等)都可以使用不同的HPLC方法進行分離提純，在一定的條件下，還可以保持其高的生物學(xué)活性，且極易回收；⑤靈敏度高：HPLC已廣泛采用高靈敏的檢測器，加上儀器本身集分離和富集于一身，使生物大分子的最小檢測下限非常低。紫外一般可達10-7ｇ，熒光可達10-9ｇ。這些是HPLCＨＰＬＣ特有的優(yōu)點，使它在近年生物大分子的分離和純化方面占據(jù)了極其重要的地位。
(一)原理
HPLC法的分離原理與經(jīng)典色譜（即層析法)相同，主要是各種溶質(zhì)在色譜柱中，差速遷移的結(jié)果。這種差速遷移現(xiàn)象，是樣品在固定相和流動相之間分配不同所引起的。
按照分離機制，可將其分為：
（１)高效離子交換色譜（HPIEC)（２)高效反相色譜（HPRPC)（３)高效疏水作用色譜（HPHIC)（４)高效排阻色譜（HPSEC)（５)高效親和色譜（HPAC)。它們的主要特性見表。
生物大分子在不同ＨＰＬＣ上的分離機制及其操作條件間的關(guān)系
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色譜類型 |
分離機制 |
操作條件 |
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固定相上的基團 |
流動相 |
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HPIEC |
靜電作用和電荷分布 |
帶電荷的陰、陽離子 |
鹽水溶液 |
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HPHIC鹽水 |
疏水作用 |
極性非極性相間 |
有機溶劑（弱極性或非極性溶液 |
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HPRPC |
疏水作用 |
非極性 |
有機溶劑、水 |
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HPSEC |
分子大小和形狀 |
惰性 |
鹽水或有機溶劑、水 |
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HPAC |
分子間特異的親和力 |
親和配體 |
鹽水溶液 |
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(二)高效液相色譜儀
高效液相色譜儀是20世紀(jì)60年代后期發(fā)展起來的一種分析儀器。設(shè)備中的基本部件有輸液泵、色譜柱和檢測器。但為了能得心應(yīng)手地工作，儀器應(yīng)當(dāng)適應(yīng)多功能的要求，同時配有梯度裝置、部分收集器、恒溫系統(tǒng)、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)以及控制系統(tǒng)等部件。
１．貯液裝置 貯液裝置是用來貯存足夠數(shù)量的洗脫液，供分離物質(zhì)之用。商品型是用不銹鋼制成，常附有脫氣設(shè)備，如攪拌、加熱、抽真空、吹氮氣等。醫(yī) 學(xué)全,在線.搜集.整理
gydjdsj.org.cn自制可用玻璃瓶代替。
２．輸液泵 泵是HPLC設(shè)備中重要的部件，是驅(qū)動溶劑和樣品通過色譜分離柱和檢測系統(tǒng)的高壓源，其性能好壞直接影響整個儀器和分析結(jié)果的可靠性
３．梯度洗脫裝置 梯度洗脫是利用兩種或兩種以上的溶劑，按照一定時間程序來改變配比濃度，以達到提高洗脫能力、改善分離效率的一種有效方法。梯度洗脫技術(shù)在高效液相色譜分離生物大分子中有很重要的實用價值，特別在分離多組分的生物大分子樣品時，各組分的k′值相差很大，很難用一種固定配比濃度的溶劑獲得良好的分離，無法將各組分的
k′都控制在有效的范圍內(nèi)。采用梯度洗脫可以按一定程序，改變?nèi)軇┑臉O性和洗脫強度，使各組分k′值均可控制在最佳條件，不但能提高分離效果和改善峰形，而且可縮短分析時間。梯度洗脫中，后被洗脫的組分比它在相應(yīng)的等濃度洗脫中的峰形更尖銳，因此檢測的靈敏度更高。
４．色譜柱 色譜柱是HPLC的核心部件，要求分離度高，柱容量大，分析速度快，而這些性能不僅與柱填料有關(guān)，也和它的結(jié)構(gòu)、裝填、使用技術(shù)有關(guān)。
理論上，色譜柱越長，柱的分離效果越好，但由于固定相的粒度對柱長產(chǎn)生了限制，在目前的條件下，只能保證10～25cm長的柱子可獲得好的重現(xiàn)性和結(jié)果。色譜柱的內(nèi)徑國外常采用4.6mm，國內(nèi)常采用5mm。隨著色譜，技術(shù)的發(fā)展，內(nèi)徑2mm的色譜柱已作為常用柱徑，因為，它可以獲得與粗徑色譜柱基本相同的分離效果，而其溶劑的消耗量僅為5mm柱子的1／6。
５．進樣器 待分析樣品從柱前的進樣器進樣，可用注射器進樣、閥進樣和自動進樣器進樣三種。其中注射器進樣和閥進樣最為常用。
６．檢測器 被分析的組分從柱子流出以后該組分在流動相總的濃度的變化可通過檢測器轉(zhuǎn)化為電信號或光信號而被檢出。檢測器必須具有足夠靈敏度，而且適應(yīng)條件范圍比較廣泛。最常用的檢測器：
（１)紫外吸收檢測器 凡是有紫外吸收的化合物都可以使用。
（２)示差折光檢測器 多用于脂質(zhì)、糖類物質(zhì)的測定，缺點是對溫度特敏感。
（３)熒光檢測器 是一種受干擾小，靈敏度很高的測驗器，只要能在紫外光激發(fā)下發(fā)射熒光的溶質(zhì)都可以使用，適用于各種氨基酸、胺類維生素、甾醇化合物的測定。
(三)色譜方法的選擇
待分離樣品對色譜法的選擇主要基于樣品的物理化學(xué)特性及溶解度。對于一個未知樣品，首先要大概了解它的分子大小，然后進一步試驗其溶解性能。根據(jù)分子大小和溶解性能便可粗略地選定一種色譜柱進行初分。
一般來說，吸附色譜法多適用于非極性樣品，它的柱容量主要決定于吸附劑表面的大小。離子交換色譜法和液－液分配色譜法多用于水溶性樣品。柱容量分別決定于離子交換量和固定相中固定液的體積。凝膠過濾色譜法可根據(jù)填料的性能不同分別用于親水和親脂性樣品。但以上選擇也不能絕對化，如吸附色譜的填料經(jīng)過特殊處理后也可以吸附很強的不溶性化合物，液－液分配色譜的正相和反相就可以分別用于分離極性和非極性化合物。關(guān)于對色譜方法的選擇，可結(jié)合有關(guān)色譜專業(yè)書籍參考選擇。
(四)操作及注意事項
１、進樣前準(zhǔn)備工作 各種溶劑一般要求新鮮配制，使用前要脫氣處理，樣品進樣前，必須用流動相充分清洗柱平衡系統(tǒng)。樣品用與流動相相同或互溶的溶劑完全溶解。醫(yī)學(xué)全在線,搜集整,理
gydjdsj.org.cn進樣前樣品要用微孔過濾器過濾。
２、洗脫 進樣后洗脫條件常按事先計劃好的溶劑程序進行。
３、柱的清洗及保存 色譜分離完畢后，要用溶劑徹底清洗色譜柱，或色譜柱用后存放時間過久也應(yīng)定期清洗。
HPLC法的應(yīng)用，除了認(rèn)真了解儀器的設(shè)計原理和各種色譜柱的性質(zhì)、應(yīng)用范圍外，要真正掌握好這門技術(shù)，還要通過大量實驗才能得心應(yīng)手。目前國內(nèi)外HPLC儀和色譜柱型號繁多，每個廠家對自己的產(chǎn)品都有比較詳細(xì)說明和應(yīng)用舉例，只要遵守操作規(guī)則及結(jié)合有關(guān)色譜的原理加以具體運用，在短期內(nèi)掌握儀器操作開展實驗工作是不困難的。
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