三 分配層析
(一)原理
在層析分離過程中，物質(zhì)既進(jìn)入固定相，又進(jìn)入流動相，此過程稱分配過程。分配層析是利用混合物中各組分在兩個互不相溶的溶劑中的分配系數(shù)不同而達(dá)到分離目的的層析技術(shù)。分配系數(shù)是指在一定的溫度，壓力和一定的溶劑系統(tǒng)中，一種物質(zhì)分配達(dá)到平衡時在兩個互不相溶的溶劑中的濃度比值，常用Ｋ來表示：
Ｋ＝溶質(zhì)在固定相的濃度（Cs)/溶質(zhì)在流動相的濃度（Cm)
不同的層析機(jī)理，其Ｋ值函義不同。吸附層析中，Ｋ值表示吸附平衡常數(shù)；分配層析中，表示分配系數(shù)；離子交換層析中，表示交換常數(shù)；親和層析中，表示親和常數(shù)。Ｋ值大表示溶質(zhì)在固定相中濃度大，洗脫時溶質(zhì)出現(xiàn)較晚。Ｋ值小表示溶質(zhì)在流動相中濃度大，在洗脫時出現(xiàn)較早。
分配層析中常用濾紙為支持物稱之為紙上分配層析。紙層析以濾紙為惰性支持物。濾紙纖維與水有較強(qiáng)的親和力，約能吸收２０～２２％的水，其中部分水與纖維素羥基以氫鍵形式存在，而濾紙纖維與有機(jī)溶劑的親和力很小，所以濾紙的結(jié)合水為固定相，以水飽和的有機(jī)溶劑為流動相（展開劑)。當(dāng)流動相沿濾紙經(jīng)過樣品點時，樣品點上的溶質(zhì)在水和有機(jī)相之間不斷進(jìn)行溶液分配，由于混合物中各組分在相同條件下具有不同的分配系數(shù)，因而隨流動相移動的快慢就有差異，于是就能將這些組分分離開來，形成距原點不等的層析點，溶質(zhì)在紙上的移動速度可用遷移率Ｒｆ值表示：
Rf=原點到層析斑點中心的距離/原點到溶劑前沿的距離
Rf值是物質(zhì)定性的基礎(chǔ)，一般分配系數(shù)大的組分，因移動速度慢，所以Rf值較小；而分配系數(shù)較小的組分，則Rf值較大�？梢愿鶕�(jù)測出的Rf值來判斷層析分離的各種物質(zhì)，當(dāng)與標(biāo)準(zhǔn)在同一條件下測得的Rf值進(jìn)行對照時，即可確定該層析物質(zhì)。
(二)操作要點
紙析法的操作分為點樣、展層、顯色、測定等。展層方式有單向（上行法、下行法)，雙向和經(jīng)向（環(huán)形)之分。為了提高分辨率，紙層析可用兩種不同的展開劑進(jìn)行雙向展層。雙向紙層析是把濾紙載成長方形或方形，一角點樣，先用一種溶劑系統(tǒng)展開，吹干后，轉(zhuǎn)90度，再用第二種溶劑系統(tǒng)進(jìn)行第二次展開。這樣，單向紙層析難以分離清楚的物質(zhì)，通過雙向紙層析往往可以獲得比較理想的分離效果。
紙層析法既可定性又可定量。定量方法一般采用剪洗法和直接比色法兩種。剪洗法是將組分在濾紙上顯色后，剪下斑點，用適當(dāng)溶劑洗脫后，用分光光度法定量測定。直接比色法是用層析掃描儀直接在濾紙上測定斑點大小和顏色深度，繪出曲線并可自動積分，計算結(jié)果。
四 離子交換層析
(一)原理
離子交換就是指液相中的離子與固相上的活性基團(tuán)離子的可逆交換反應(yīng)。
gydjdsj.org.cn利用這個反應(yīng)將要分離的混合物先在一定pH值的溶液中全部解離，而后流過固定相使之與固相上的離子進(jìn)行交換，吸附于固相上，再根據(jù)混合物中解離度的差別，用不同pH值的溶液
分別洗脫下來，達(dá)到分離混合物中組分的目的。
離子交換層析技術(shù)除大量應(yīng)用于分離生物化學(xué)代謝物質(zhì)的工業(yè)生產(chǎn)外，還廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)和分子生物學(xué)的理論研究。近年來，該技術(shù)與其它技術(shù)相結(jié)合，制成了固相肽自動合成裝置、氨基酸自動分析儀，核苷酸自動分析儀、氣相色譜儀、蛋白質(zhì)合成儀等。離子交換層析技術(shù)已經(jīng)成為生化領(lǐng)域各個方面的基本技術(shù)之一。
(二)離子交換劑的類型
離子交換層析中固相稱為交換劑。它是一種高分子不溶物質(zhì)。目前常用的有人工合成的樹脂、纖維素、葡聚糖、瓊脂糖等。在這些不溶性母體上引入不同的活性基團(tuán)，即具有離子交換作用，成為各種類型的離子交換劑。引入母體上的活性基團(tuán)主要分酸性和堿性兩類，酸性基團(tuán)能解離出H+可與溶液中陽離子交換。所以這類離子交換劑稱為陽離子交換劑；堿性基團(tuán)因能解離出OH-與溶液中的陰離子交換，所以這類離子交換劑稱為陰離子交換劑。由于引入的酸性和堿性基團(tuán)的強(qiáng)弱不同，這兩類離子交換劑又分為強(qiáng)酸型和弱酸型以及強(qiáng)堿型和弱堿型。如：酸性樹脂中含磺酸基（－SO3H)的稱強(qiáng)酸型；含磷酸基（－PO3H2)、亞磷酸基（－PO3H)的稱中強(qiáng)酸型；含有羧基（－COOH)、羥基（－OH)的稱弱酸型。堿性樹脂中含季胺［－N+(CH3)3］的稱強(qiáng)堿型，含叔胺［－N(CH3)2］、仲胺（NHCH3)、伯胺（－NH2)基的稱弱堿型。
離子交換劑的作用原理如下：
陽離子交換劑分子中具有酸性基團(tuán)，能和流動相中的陽離子交換：
R-SO3-H+＋M+---→R-SO3M＋H+
陰離子交換劑分子中具有堿性基團(tuán)，能和流動相中的陰離子進(jìn)行交換：
R4-N+OH-+W----→R4-N+ W-＋OH-
OH-＋H+---→H2O
（Ｍ＋代表溶液中陽離子，Ｗ－代表溶液中陰離子)
由于不同生物大分子的電荷密度分布不同，電荷量不等，等電點的差異及分子大小的區(qū)別，因而與離子交換劑的結(jié)合強(qiáng)弱也不同，當(dāng)它們被結(jié)合到固定相交換基團(tuán)上以后，主要依靠增加緩沖溶液的離子強(qiáng)度或改變酸堿度來進(jìn)行洗脫。當(dāng)緩沖液離子強(qiáng)度增加時，即增加了它與生物大分子對交換基團(tuán)競爭吸附的能力，把生物大分子置換下來，改變酸堿度，使緩沖溶液的ｐＨ接近生物大分子的等電點，其凈電荷為零，從而可被洗脫。
(三)離子交換層析基本操作
１、交換劑的選擇 交換劑的選擇必須考慮到被分離物質(zhì)及交換劑的性質(zhì)，如被分離的物質(zhì)是陽離子就應(yīng)選用陽離子交換劑，反之則選用陰離子交換劑。溶液中的離子在交換劑中交換吸附不僅受自身電荷數(shù)的影響，也受到它與離子交換劑的非極性親和力及交換劑空間結(jié)構(gòu)大小等因素影響。因此在分離某物質(zhì)時，必須根據(jù)物質(zhì)的解離性能、分子大小，選擇適當(dāng)類型的離子交換劑。再如像分離蛋白質(zhì)，核酸時，為了不改變其生物活性，要選用條件溫和的交換劑，如纖維素交換劑，而不能選用交換條件強(qiáng)烈的交換劑，如磺酸型樹脂等。
２、交換劑的處理、轉(zhuǎn)型與再生 離子交換劑在使用前必須進(jìn)行處理，即將離子交換劑先用蒸餾水浸透使之充分吸水膨脹，并用無離子水洗至澄清，以去除漂浮物及雜質(zhì)等。然后用酸和堿分別處理，以除去某些不溶物。如離子交換樹脂的處理方法是：先用４倍量的2mol/LHCl浸泡4h以上，除去酸液，用無離子水洗至中性，再加４倍量2mol/LNaOH浸泡4h以上，除去堿液，再用無離子水洗至中性備用。離子交換纖維素則用0.5mol/L的NaOH和0.5mol/LHCl處理。離子交換葡聚糖凝膠一般不用酸堿處理，使用前需在中性溶液中完全膨脹（室溫1～2天，沸水浴2h)。處理過程中不需去除細(xì)小顆粒。避免強(qiáng)烈的攪拌，清洗時，最好用布氏漏斗除濾液，代替傾注法以減少損失。
用過的交換劑，經(jīng)處理后還可繼續(xù)使用，處理過程稱為“再生”。一般是用酸和堿分別浸泡，再用水洗至中性。但離子交換樹脂不一定要用酸和堿處理，即只要“轉(zhuǎn)型”就可以了。所謂轉(zhuǎn)型就是使用時希望樹脂帶上何種離子。如希望陽樹脂帶Na+，則用NaOH處理；如希望樹脂帶Ｈ+則用HCl處理；希望它帶NH4+，則用NH4OH或NH4Cl處理。陰樹脂轉(zhuǎn)型也是同樣道理，若希望帶Cl-則用HCl，希望帶OH-則用NaOH�？傊瑯渲幚�,再生和轉(zhuǎn)型的結(jié)果是希望帶上我們需要的離子，因此最后的處理即是轉(zhuǎn)型處理，不論轉(zhuǎn)為何型，前后都要用無離子水洗至中性（若最后一步用堿處理，水洗至流出液pH＜８；用酸處理的，水洗的流出液pH＞６即可)。
３、裝柱 離子交換層析多用柱層析法。
gydjdsj.org.cn首先應(yīng)將柱放垂直，在柱內(nèi)裝入1/3的溶液，然后將處理好的交換劑用溶液稀釋，一邊攪拌一邊加入柱內(nèi)，使交換劑均勻沉降，至交換柱高1cm左右，打開下口，使溶液慢慢流出，同時不斷地加入攪勻的交換劑，直達(dá)到要求的柱高為止。裝好的柱要求沒有明顯的分界線，不能有氣泡，柱床面要平坦。裝好的柱床面上要保持一層溶液，以防空氣進(jìn)入。
４、樣品上柱 柱裝完畢后，用所需的緩沖液平衡，上樣時應(yīng)把柱面上的溶液放出，至液面與柱床面相同高度，用滴管加入樣品，打開下口，使樣品進(jìn)入柱床，當(dāng)樣品液與柱床面相平時，用少量緩沖液洗管壁，這樣使樣品全部進(jìn)入柱內(nèi)，以防止出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。
５、洗脫 一般是根據(jù)所用洗脫液比吸附物質(zhì)具有更活潑的離子或基團(tuán)，從而把吸附物質(zhì)頂替出來，利用此原則選擇各種洗脫液。洗脫液是由不同離子強(qiáng)度和不同pH的緩沖液組成，用以分離樣品的不同組分。改變洗脫方式主要有分步洗脫（或分段洗脫)和連續(xù)梯度洗脫法。
（１)分步洗脫法 預(yù)先配制不同離子強(qiáng)度的緩沖溶液，分段換用離子強(qiáng)度由低到高，pH相同或不同的洗脫液以洗脫生物大分子的各種組分。
（２)梯度洗脫法 早期采用兩個直徑相同底部相通的大型容器，將離子強(qiáng)度低的緩沖溶液放入一容器（混合瓶)中，其下端裝有一個攪拌器，并連接到色譜柱的頂端，另一個容器存放離子強(qiáng)度較高的緩沖溶液。在洗脫過程中，因緩沖液由貯存瓶不斷流入經(jīng)攪拌器的混合瓶中，使流入色譜柱的洗脫液離子強(qiáng)度呈梯度增加，而pH亦逐漸變化。這樣可分管自動收集，使結(jié)構(gòu)相近的生物大分子較易分離。近期，人們已設(shè)計出了可以自動梯度洗脫的分離洗脫，具有非常好的重現(xiàn)性。
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