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一 基本原理
(一)原理
層析技術(shù)是近代生物化學(xué)最常用的分離技術(shù)之一，它是利用混合物中各組分的理化性質(zhì)（吸附力、分子形狀和大小、分子極性、分子親和力、分配系數(shù)等)的差異，在物質(zhì)經(jīng)過兩相（一個(gè)固定相，一個(gè)流動(dòng)相)組成的體系中，不斷地進(jìn)行交換、分配、吸附及解吸附等過程，可將各組分間的微小差異經(jīng)過相同的重復(fù)過程而達(dá)到分離。配合相應(yīng)的化學(xué)、電學(xué)和電化學(xué)檢測(cè)手段，可用于定性、定量和純化某種物質(zhì)。層析法的特點(diǎn)是分離率、靈敏度、選擇性均很高的一種分離方法。尤其適合樣品含量少，而雜質(zhì)含量多的復(fù)雜生物樣品的分析。固定相可以是固體也可以是被固體或凝膠所支持的液體；同樣流動(dòng)相可以是液體也可是氣體。
(二)分類
按分離的原理可分為五類：
１、吸附層析： 固定相是固體吸附劑，利用各組分在吸附劑表面吸附能力的差別而分離。
２、分配層析： 固定相為液體，利用各組分在兩液相中分配系數(shù)的差別或溶解度不同使物質(zhì)分離。
３、離子交換層析： 固定相為離子交換劑，利用各組分對(duì)離子交換劑的親和力不同而進(jìn)行分離。
４、凝膠層析： 固定相為多孔凝膠，利用各組分在凝膠上受阻滯程度不同而進(jìn)行分離。
５、親和層析：根據(jù)生物特異性吸附進(jìn)行分離，固定相只能和一種待分離組分有高度特異性的親和能力者結(jié)合，而與無結(jié)合能力的其它組分分離。
按操作方式不同分為三類：
１、紙層析 以濾紙作為液體的載體，點(diǎn)樣后，用流動(dòng)相展開，以達(dá)到組分分離目的。
２、薄層層析 以一定顆粒度的不溶性物質(zhì)，均勻涂鋪在薄板上。點(diǎn)樣后，用流動(dòng)相展開，使組分達(dá)到分離。
３、柱層析 將固定相裝柱后，使樣品沿一個(gè)方向移動(dòng)，以達(dá)到分離目的。
二 吸附層析
(一)原理
吸附作用是指某些物質(zhì)（稱吸附劑)能夠從溶液中將溶質(zhì)濃集在其表面的現(xiàn)象。吸附劑吸附能力的強(qiáng)弱除決定于吸附劑和被吸附物質(zhì)本身的性質(zhì)外，還和周圍溶液的組成有密切關(guān)系。當(dāng)改變吸附劑周圍溶液的成分時(shí)，吸附劑的吸附能力即可發(fā)生變化，往往可使能吸附物質(zhì)從吸附劑上解吸下來，這種解吸過程稱為洗脫或展層。當(dāng)樣品中的物質(zhì)被吸附劑吸附后，用適當(dāng)?shù)南疵撘簺_洗，就能改變吸附劑的吸附能力，使被吸附的物質(zhì)解吸下來，隨著洗脫液向前移動(dòng)，該物質(zhì)又遇到前面新的吸附劑而再次被吸附，在后來的洗脫液的沖洗下又重新解吸下來，繼續(xù)向前移動(dòng)。經(jīng)過這樣反復(fù)的吸附—解吸附—再吸附—再解吸的過程，物質(zhì)就可以不斷向前移動(dòng)。由于吸附劑對(duì)樣品中各組分的吸附能力不同，它們?cè)谙疵搫┑臎_洗下移動(dòng)的速度也就不同，因而能逐漸分離開來。
(二)吸附劑的選擇
吸附劑的選擇是否合適是吸附層析的關(guān)鍵。常用的吸附劑有硅膠、氧化鋁、硅藻土、纖維素等。硅膠為微酸性吸附劑，適合分離酸性和中性物質(zhì)；氧化鋁是微堿性吸附劑，適合分離堿性和中性物質(zhì)；硅藻土和纖維素為中性吸附劑，適合分離中性物質(zhì)。gydjdsj.org.cn吸附劑的顆粒應(yīng)有一定細(xì)度，并且粒度要均勻。一般顆粒直徑為無機(jī)類0.07～0.1mm（150～200目)；有機(jī)類0.1～0.2mm（70～140目)。顆粒太粗，層析時(shí)溶劑推進(jìn)快，但分離效果差，而顆粒太細(xì)，展開太慢，易產(chǎn)生斑點(diǎn)不集中并有拖尾現(xiàn)象。
(三)吸附能力
一般用活度來表示吸附劑的吸附能力，吸附能力主要受吸附劑含水量的影響，其由強(qiáng)到弱的程度以Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ表示。吸附劑活度強(qiáng)時(shí)能吸附極性較小的基團(tuán)；吸附劑活度弱時(shí)對(duì)非極性基團(tuán)吸附能力也較強(qiáng)。一般利用加熱烘干的方法，減少吸附劑的水份，從而增加其活度。通常，分離水溶性物質(zhì)時(shí)，因其本身具有較強(qiáng)極性，故吸附劑活度要弱一些；相反，分離脂溶性物質(zhì)時(shí)，吸附劑活度要強(qiáng)一些。
吸附層析根據(jù)吸附劑的裝填方式可分為柱層析和薄層層析法兩種。
（１)吸附柱層析法 選擇一根適當(dāng)尺寸的玻璃管，在管的底部墊以尼龍網(wǎng)、玻璃棉或燒結(jié)玻璃板等，再填裝一定量的吸附劑，然后在頂部加入樣品溶液，待樣品全部流入吸附劑內(nèi)后，再加入洗脫液進(jìn)行洗脫，不同組分即以不同的速度向下流動(dòng)而逐漸分離開來。最后從下端出口處流出，分步收集洗脫液，即可得到各組分的溶液，供進(jìn)一步處理和測(cè)定。
（２)吸附薄層層析法 薄層層析法是把吸附劑均勻地在玻璃板上鋪成薄層。把要分析的樣品加在薄層的一端，在密閉的容器中，用適當(dāng)?shù)娜軇┱箤雍筮_(dá)到分離、鑒定的目的。
薄層層析的優(yōu)點(diǎn)是：設(shè)備簡(jiǎn)單、操作容易、層析時(shí)間短、分離效率高，是發(fā)展較快的一種微量，快速的層析方法，可用于氨基酸、核苷酸、糖類、脂類和激素等物質(zhì)的分離和鑒定。
薄層層析的操作方法包括制薄板、點(diǎn)樣、展層、顯色等過程，薄層經(jīng)顯色確定斑點(diǎn)位置后，計(jì)算Rf值。然后與文獻(xiàn)記載的Rf值比較以鑒定各種物質(zhì)。
