五 凝膠層析
(一)原理
凝膠層析是20世紀(jì)60年代發(fā)展起來的一種分離分析方法。其法有許多同義詞，如凝膠過濾、分子篩過濾、凝膠滲透層析等。
凝膠層析是利用具有一定孔徑大小的多孔凝膠作固定相的層析技術(shù)。凝膠的孔隙猶如“篩眼”。當(dāng)被分離的物質(zhì)流過凝膠柱時(shí)，分子大于凝膠“篩眼”范圍的物質(zhì)完全被排阻，不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，只能隨著溶劑在凝膠顆粒之間流動(dòng)，因此受到的阻滯作用小，流程短，流速快而先流出層析柱；分子小于“篩眼”的物質(zhì)則可完全滲入凝膠顆粒的“篩眼”中。因此，受到的阻滯作用大，而且從一個(gè)顆粒的“篩眼”又進(jìn)入另一顆粒的“篩眼”，其流程長，流速也就慢，從層析柱中流出就較晚。若分子大小介于上述完全排阻或完全滲入凝膠的物質(zhì)，則居二者之間從柱中流出。
gydjdsj.org.cn從流出先后次序的不同即可達(dá)到分離和純化被分離物質(zhì)的目的。
凝膠的這種特性又稱分子篩效應(yīng)。洗脫時(shí)峰的位置和該物質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量有直接的定量關(guān)系。在一根凝膠柱中，顆粒間自由空間所含溶液的體積稱為外水體積Vo，不能進(jìn)入凝膠孔徑的那些大分子，當(dāng)洗脫體積為Vo時(shí)，出現(xiàn)洗脫峰。凝膠顆粒內(nèi)部孔穴的總體積稱為內(nèi)水體積Vi，能全部透入凝膠的那些小分子，當(dāng)洗脫體積為Vo＋Vi時(shí)出現(xiàn)洗脫峰，介于其間的分子將在洗脫體積為Vo＋Ve時(shí)，出現(xiàn)洗脫峰。
我們將分子篩分配系數(shù)定義為：Ｋ=Ve／Vi
若生物大分子的分子為球形，其Ｋ與生物大分子的相對(duì)分子質(zhì)量Mr存在如下關(guān)系：
K=-blgMr＋ｃ
其中ｂ和ｃ為常數(shù)。實(shí)驗(yàn)已證實(shí)這一關(guān)系的存在。
(二)凝膠的種類
用作凝膠的載體物質(zhì)有交聯(lián)葡聚糖、聚丙烯酰胺和瓊脂糖。
１、交聯(lián)葡聚糖凝膠
交聯(lián)葡聚糖商品名為Sephadex，它的原料是細(xì)菌分泌的鏈狀葡聚糖。通過交聯(lián)劑1-氯代-2,3-環(huán)氧丙烷交聯(lián)而成。交聯(lián)劑添加越多，孔徑越小，吸水量也就越��；反之越大。商品Sephadex以Ｇ值表示不同交聯(lián)度，Ｇ值越大，空穴也越大，Ｇ后邊的數(shù)字表示每克干膠膨脹時(shí)吸水量的10倍，Ｇ-25表示每克干膠可吸附2.5ｇ水。
一般將SephadexＧ-10至Ｇ-50的凝膠稱為硬膠，因其吸水量比較�。欢鳶ephadexＧ-75、Ｇ-200由于吸水量大，膨脹度較大，稱之為軟膠。
層析時(shí)選用何種凝膠，需根據(jù)被分離物質(zhì)分子的大小及分離目的不同而決定。一般把用于小分子物質(zhì)如無機(jī)鹽從有機(jī)大分子中分離出來的層析，多使用“篩眼”小的凝膠如SephadexＧ-10至Ｇ-50；分離分子大于10 000以上的兩種分子大小近似的物質(zhì)時(shí)，使用“篩眼”大的Ｇ-75以上的凝膠。
凝膠基本上是一種不帶電荷的球狀物質(zhì)。本身不會(huì)與被分離的物質(zhì)相互作用，所以分離效果好。但葡聚糖凝膠分子上含有的羥基，能與某些蛋白質(zhì)的堿性基團(tuán)相互作用，吸附少量蛋白質(zhì)。為此，在洗脫時(shí)可在洗脫液中加入
氯化鈉等中性鹽，提高離子強(qiáng)度，當(dāng)離子強(qiáng)度大于0.05時(shí)即可克服這種吸附。
２．聚丙烯酰胺凝膠
聚丙烯酰胺凝膠是丙烯酰胺和N，N′-次甲基二丙烯酰胺聚合而成。其商品名為生物膠Ｐ（Bio-GelP)。其孔穴大小也是隨交聯(lián)增多而減少，并用Ｐ值表示不同的交聯(lián)度。Ｐ值越大，孔徑也越大。
３．瓊脂糖凝膠
瓊脂糖是從
海藻瓊脂中分離除去瓊脂膠后的中性組分。它是Ｄ-半乳糖和3，6-
脫水Ｌ-半乳糖相間重復(fù)結(jié)合而成的鏈狀化合物。
這種糖鏈依靠糖基之間的氫鍵作用，形成穩(wěn)定的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的疏密依靠改變瓊脂糖濃度的方法來控制，因此商品也是以含水狀態(tài)供應(yīng)。因?yàn)榄傊悄z靠的是氫鍵相交聯(lián)，一般型號(hào)只能在0～40℃以及Ph4～9范圍內(nèi)使用。近年，應(yīng)用交聯(lián)劑制備得到的cl型和FF型瓊脂糖則有比較好的穩(wěn)定性，能用于濃脲、胍、有機(jī)溶劑及非離子型去污劑溶液，還能經(jīng)受110～120℃高壓滅菌處理，對(duì)生物大分子的吸附能力也特別低。無論是哪種瓊脂糖凝膠，其機(jī)械強(qiáng)度都比葡聚糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠好得多，同時(shí)它對(duì)生物大分子等高分子的吸附作用也小得多。另外，瓊脂糖凝膠適用相對(duì)分子質(zhì)量的范圍寬，最大可以到108，這一點(diǎn)是另外兩種凝膠所無法達(dá)到的。正由于以上這些優(yōu)點(diǎn)，它的應(yīng)用受到人們的重視。瓊脂糖的商品名為Sepharose或Bio-GelA。
(三)操作方法
１、凝膠的處理 為了獲得合適的流速和良好的分離，凝膠粒子在使用前需經(jīng)一定處理，主要是將凝膠的保存液更換到分離蛋白質(zhì)的洗脫液中，對(duì)于Sephadex系列凝膠在使用前需充分的膨脹與浮選。
２、裝柱 取適當(dāng)長度的色譜柱（Ｇ-200選用2.5cm×100cm)，底部鋪上尼龍篩網(wǎng)或玻璃絲，以不漏粒子為準(zhǔn)。用緩沖液（如PBS)飽和凝膠粒子，置室溫1h后上柱。自頂端傾注凝膠懸浮液時(shí)，應(yīng)沿直插到
管底的玻璃棒緩緩流入，以免產(chǎn)生氣泡與漏出粒子。為了防止分層，最好將凝膠懸液放于貯液瓶中，連續(xù)加入。
３、柱填充的檢查和Vo的測定 檢查柱子填充是否正確的最好方法是用此柱分離某些有色物質(zhì)。藍(lán)色葡聚糖-2 000是常用的一種物質(zhì)，它是一種高分子葡聚糖，含有藍(lán)色發(fā)色基團(tuán)，因此可在一次操作中檢查柱子的填充狀況和測定出滯留容量Vo。方法是把0.2%的藍(lán)色葡聚糖-2 000溶液（1/50～1/100柱床體積)加到柱子上，洗脫液的離子強(qiáng)度應(yīng)為0.02或更高。在色譜分離過程中，可能出現(xiàn)的色帶形狀。柱子填充良好是獲得好的分離結(jié)果所必需的。如果用藍(lán)色葡聚糖進(jìn)行實(shí)驗(yàn)后獲得了一個(gè)不好的色譜帶，那么就說明凝膠床沒有填好。在這種情況下，柱子必須重新裝填。
４、加樣 在加樣時(shí)，為了不擾亂凝膠表面，可在頂部放上一層圓形濾紙或尼龍網(wǎng)，也可覆蓋一層SephadexG-25（5mm厚)的凝膠。樣品要有一定的濃度和體積。通常為床柱體積的1%～10%，濃度不宜超過1%～4%。
５、洗脫 洗脫劑多采用低離子強(qiáng)度的鹽溶液。
gydjdsj.org.cn各種類型凝膠對(duì)流速要求不一。
６、再生 樣品洗脫完畢后，凝膠柱即已再生。一次裝柱，可反復(fù)使用多次。因此操作簡便，重復(fù)性高。
７、保存 各型凝膠懸液加防腐劑或滅菌后，可置冰箱保存數(shù)月。防腐劑類型很多，最常用的有0.02%的疊氮化鈉與0.05%的柳硫汞等，也可用高壓蒸汽0.1MPa 30min滅菌。
(四)應(yīng)用
凝膠層析是一種快速、簡便的分離分析技術(shù)。由于設(shè)備簡單，操作方便，不需有機(jī)溶劑，對(duì)高分子物質(zhì)有很高的分離效果，廣泛用于酶、蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸、核苷酸、多糖、激素、抗生的素、生物堿等物質(zhì)的分離和提純，也可用于蛋白質(zhì)溶液的脫鹽及高分子溶液的濃縮、蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的測定等。
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