| 公開(公告)號(hào) | CN1611610A |
| 公開(公告)日 | 2005.05.04 |
| 申請(qǐng)(專利)號(hào) | CN200310106719.5 |
| 申請(qǐng)日期 | 2003.10.27 |
| 專利名稱 | 甘油氧化酶制劑的制備方法及其在測(cè)定血清甘油三酯中的應(yīng)用 |
| 主分類號(hào) | C12Q1/26 |
| 分類號(hào) | C12Q1/26;C12Q1/61;C12N9/02 |
| 分案原申請(qǐng)?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(qǐng)(專利權(quán))人 | 天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所 |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 李明潤(rùn);邢來君;關(guān)俊玲;李明春;高向耘;李志新;李明;王英;米沙 |
| 地址 | 300070天津市和平區(qū)貴州路96號(hào) |
| 頒證日 | |
| 國(guó)際申請(qǐng) | |
| 進(jìn)入國(guó)家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 天津佳盟知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 |
| 代理人 | 侯力 |
| 國(guó)省代碼 | 天津;12 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 一種甘油氧化酶制劑的制備方法，其特征為該方法是按照以下步驟實(shí)現(xiàn)的：——菌種選育與培養(yǎng)：取日本曲霉AS8586接孢子于土豆斜面培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)4天；——亞硝基胍誘變：將培養(yǎng)的AS8586土豆斜面培養(yǎng)基用無菌水沖洗制備孢子懸液，并稀釋至107/ml孢子；按重量體積比1∶1的比例，稱取亞硝基胍于三角瓶中，接入上述孢子懸液并充分混勻后，搖床震蕩100分鐘時(shí)取出0.5ml菌液，用生理鹽水稀釋至102/ml孢子，取0.1ml涂布土豆斜面培養(yǎng)基上30℃溫箱培養(yǎng)，長(zhǎng)出單菌落時(shí)，隨即挑取20個(gè)菌落劃斜面，溫箱培養(yǎng)24小時(shí)，將菌種斜面用無菌水沖洗制備孢子懸液按體積比1∶100的比例將孢子懸液接入盛有原始發(fā)酵液體培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃搖床培養(yǎng)48小時(shí)；——菌體收集：以布氏漏斗真空抽濾菌體，蒸餾水充分洗滌去除殘留的發(fā)酵液體培養(yǎng)基至濾液無色透明為止，抽干后的菌體稱重；——液氮研磨：將102/ml的菌體放入研缽，按菌體1ml加1克石英沙和1ml液氮的比例，加入石英沙和液氮，充分研磨，重復(fù)6次，溶于100ml的0.05mol/L硼酸緩沖液中使pH為9.5，充分混勻，于8000rpm離心30分鐘，收集上清液；——硫酸銨分級(jí)沉淀：將盛有上清液的燒杯放在另一裝有冰水的大燒杯內(nèi)，磁力攪拌，邊攪拌邊徐徐加入硫酸銨至40％飽和度，4℃靜止1小時(shí)后20000g離心20分鐘，收集上清液繼續(xù)加入硫酸銨至80％飽和度，攪拌10分鐘，4℃靜止1小時(shí)后20000g離心20分鐘，收集沉淀；——蛋白脫鹽：將分離得到的沉淀物，溶于0.05mol/L的硼酸緩沖液中，裝入透析帶，在體積比為1∶100的同種緩沖液中透析除鹽24小時(shí)，其中更換透析液3次；——凝膠過濾層析：將透析后樣品上樣于預(yù)先經(jīng)0.05mol/L硼酸緩沖液充分平衡的1×100cm的SephadexG-200柱進(jìn)行層析分離，流速為0.2ml/min每管收集20min；洗脫液與平衡液相同，層析時(shí)監(jiān)測(cè)A280紫外吸收和酶的活性，確定GO所在的蛋白峰，合并收集液；——離子交換層析：將上述合并收集的組分上樣于DEAE-SephadexA-25柱，進(jìn)行離子層析分離、收集紫外吸收部分酶活在5u/ml以上組分；——冷凍干燥：將上述得到的樣品放入培養(yǎng)皿，-20℃冷凍過夜，第二天放入冷凍干燥機(jī)凍干10小時(shí)，即可制得甘油氧化酶制劑成品。 |
| 摘要 | 甘油氧化酶(GO)制劑的制備方法及其在測(cè)定血清甘油三酯中的應(yīng)用。制備方法由菌種選育與培養(yǎng)，亞硝基胍誘變，菌體收集，液氮研磨，硫酸銨分級(jí)沉淀，蛋白脫鹽，凝膠過濾層析，離子交換層析，冷凍干燥等步驟完成。GO的應(yīng)用方法包括試劑配制：即0.1mol/L TES緩沖液配制、儲(chǔ)存液配制、三酶合劑配制；貯存液與三酶合劑按體積比14∶1比例配制成工作液，空白管、標(biāo)準(zhǔn)管、樣品管各注入3.0ml工作液，并分別注入0.05ml蒸餾水、0.05ml甘油標(biāo)準(zhǔn)液、0.05ml待測(cè)樣品液，37℃水浴保溫20分鐘，500nm波長(zhǎng)比色，計(jì)算TG含量。本發(fā)明解決了GO的批量化生產(chǎn)問題，其應(yīng)用代替了磷酸甘油氧化酶法(GPO法)中的GK和GPO兩種酶，大大降低了原材料成本，其推廣應(yīng)用可產(chǎn)生明顯的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。 |
| 國(guó)際公布 |
