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1.2.1DNA的提取 改良Miller鹽析法[2]提取的DNA溶于TE緩沖液中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/P>
1.2.2聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)連接酶檢測(cè)反應(yīng)(PCRLDR)分析采用Primer 3.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物,見表1。表1hCHK2基因3個(gè)SNP位點(diǎn)的上、下游引物序列hCHK2基因SNP位點(diǎn)上游引物(5′3′)下游引物(5′3′)產(chǎn)物長(zhǎng)度
PCR反應(yīng)體系：總體積20 μl，含模板DNA 1 μl，1×Buffer緩沖液2 μl，Mg2+0.6 μl，dNTP 2 μl，Taq DNA聚合酶0.3 μl，1×QSolution 4 μl，Primer引物0.4 μl，濃度0.2 pM，加水補(bǔ)足。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性15 min;94℃30 s，57℃退火1 min，72℃延伸7 min，35個(gè)循環(huán)。根據(jù)LDR探針設(shè)計(jì)原則[3]設(shè)計(jì)LDR的熒光探針，對(duì)該基因待檢測(cè)的SNP位點(diǎn)，在位點(diǎn)的5’方向根據(jù)SNP的堿基類型設(shè)計(jì)兩條特異性探針，每條探針的3’末端堿基分別與此位點(diǎn)的一種等位基因型相對(duì)應(yīng)，此外在該位點(diǎn)的3’方向序列中設(shè)計(jì)一條末端帶有FAM修飾的通用探針(藍(lán)色熒光)，見表2。表2hCHK2基因3個(gè)SNP位點(diǎn)LDR連接反應(yīng)探針序列探針名稱探針序列(5′3′)產(chǎn)物長(zhǎng)度反應(yīng)條件：95℃2 min，94℃30 s，60℃2 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。
1.2.3基因分型取LDR產(chǎn)物、內(nèi)參比熒光ROX和測(cè)序膠上樣緩沖液(loading buffer)各1 μl等體積混合，應(yīng)用377型DNA測(cè)序儀(ABI，美國(guó))檢測(cè)結(jié)果。以ROX為內(nèi)參分子量標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)不同長(zhǎng)度DNA片段的熒光強(qiáng)度，并根據(jù)產(chǎn)物片斷大小確定基因型。
1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理全部統(tǒng)計(jì)分析在SPSS15.0軟件上進(jìn)行。HardyWeinberg吻合度檢驗(yàn)及兩組間基因多態(tài)性位點(diǎn)的基因型和基因頻率比較采用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
2結(jié)果
2.1PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果PCR反應(yīng)產(chǎn)物用3%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見圖1。
2.2hCHK2 rs2278022、rs2602431和rs2970077位點(diǎn)基因分型結(jié)果應(yīng)用ABI公司Model自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行序列分析，確定hCHK2 rs2278022、rs2602431和rs2970077位點(diǎn)基因型，結(jié)果見圖2醫(yī).學(xué).全.在.線gydjdsj.org.cn。
2.3遺傳平衡檢驗(yàn)經(jīng)HardyWeinberg遺傳平衡檢驗(yàn)得出hCHK2基因rs2602431、rs2278022、rs2970077位點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的P值均>0.05，符合HardyWeinberg遺傳平衡定律[4]，表明研究對(duì)象的選擇無遺傳學(xué)偏差，該群體是遺傳平衡群體，具有一定的人群代表性。
2.4hCHK2 rs2278022、rs2602431和rs2970077 3個(gè)位點(diǎn)等位基因和基因型與食管癌易感性的關(guān)系hCHK2 rs2278022、rs2602431和rs2970077 3個(gè)SNP位點(diǎn)基因型在病例組和對(duì)照組中的頻率分布經(jīng)χ2檢驗(yàn)后，不同位點(diǎn)基因型頻率分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，結(jié)果見表3。
3討論
食管癌(Esophageal Cancer，EC)是全世界最常見的十大惡性腫瘤之一，全世界每年新發(fā)病例可達(dá)48萬人[5]，是發(fā)展中國(guó)家最常見的一種消化道惡性腫瘤，是危害我國(guó)居民健康的主要惡性腫瘤之一[6]。食管癌的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)多因素、多階段的綜合過程，其發(fā)病機(jī)制目前尚未明確。由于DNA損傷是細(xì)胞癌變的前提，為確保DNA損傷后遺傳物質(zhì)的完整性和正確性，機(jī)體細(xì)胞的DNA修復(fù)系統(tǒng)和細(xì)胞周期調(diào)控系統(tǒng)發(fā)揮了重大作用，因此對(duì)細(xì)胞調(diào)控基因hCHK2(細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)激酶2)基因的多態(tài)性進(jìn)行了檢測(cè)。細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)激酶2 (checkpoint kinase 2, CHK2)基因位于染色體22q12.1，包含14個(gè)外顯子，其cDNA全長(zhǎng)為1 731 bp。細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)在細(xì)胞周期調(diào)控中起重要作用，可以檢測(cè)細(xì)胞外界或內(nèi)部的各種異常，從而抑制細(xì)胞周期的進(jìn)程，同時(shí)修復(fù)損傷或使不能修復(fù)的細(xì)胞進(jìn)入凋亡。檢測(cè)點(diǎn)作為保護(hù)機(jī)制可確保遺傳的穩(wěn)定性。一旦檢測(cè)點(diǎn)發(fā)生缺陷，帶有損傷的細(xì)胞可能會(huì)異常擴(kuò)增，使腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)大大增加。對(duì)于hCHK2基因，Zheng等[7]的研究表明，第84密碼子A252G多態(tài)性與患頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)性也有關(guān);Jonine等[8]的研究表明，CHEK2
