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A.倒置顯微鏡下觀察(×100);B.心肌細胞超微結(jié)構(gòu)觀察(×20 000)
2.2 心肌細胞成活率的測定 取細胞懸液，稀釋到109/L，用0.4%臺盼藍染色，未著色的為活細胞,呈藍色的為死細胞,顯微鏡下觀察并計算心肌細胞的成活率，計數(shù)200個細胞，11個染藍色，成活率為94.5%。
2.3 pNI4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染心肌細胞后倒置顯微鏡觀察結(jié)果 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前的心肌細胞在倒置顯微鏡下可見：心肌細胞伸展為圓形、梭形、棒狀、星狀及分叉狀等;胞核多為1個，間或多個，核呈圓形，核仁清晰;可見到自發(fā)性搏動，但節(jié)律不一，慢的1 min僅數(shù)次，快的可達120次/min以上;細胞間形成細胞簇，可出現(xiàn)同簇細胞的同步搏動(圖2A)。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后第3天，心肌細胞數(shù)量減少，心肌細胞主要為梭形和分叉狀;胞核為1～2個，核呈圓形，但是核仁不清晰;仍然可以見到自發(fā)性搏動，但是節(jié)律不齊;可見到心肌細胞呈空泡樣改變，很難看見成簇的心肌細胞(圖2B)。圖2 pNI4轉(zhuǎn)染前后的心肌細胞形態(tài)比較(×400)
A.轉(zhuǎn)染前;B.轉(zhuǎn)染后
2.4 CVB3m攻擊后心肌細胞形態(tài)觀察結(jié)果 CVB3m病毒攻擊后3天左右，倒置顯微鏡下可見成纖維細胞破裂崩解，細胞核固縮，飄浮在培養(yǎng)液中。心肌細胞沒有出現(xiàn)明顯的細胞病變(CPE)，仍然搏動但是較慢、不規(guī)則，心肌細胞仍然貼壁生長(圖3);超微結(jié)構(gòu)觀察可見心肌細胞呈矩形，核位于質(zhì)膜下，核周細胞器豐富，核膜增厚，細胞核形狀可見畸變，核內(nèi)染色質(zhì)明顯固縮，細胞膜和肌原纖維基本完整，但是線粒體膜部分破裂，線粒體嵴呈絮狀改變或者腫脹而大小不一，胞質(zhì)內(nèi)可見到結(jié)晶狀的病毒顆粒，呈黑色點狀排列(圖4)。圖3 CVB3m感染的心肌細胞形態(tài)學(xué)觀察(×100)
2.5 pNI4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染心肌細胞后心肌酶檢測結(jié)果 分別在轉(zhuǎn)染前(1、3天)和轉(zhuǎn)染后(1、3、6天)吸取細胞上清液，凍存后使用日立7600型生化自動分析儀來測定心肌細胞酶。結(jié)果顯示質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，病毒在心肌細胞中合成復(fù)制，導(dǎo)致心肌細胞部分破裂崩解，致使心肌酶都有不同程度的升高(表1);經(jīng)過3天以后，心肌酶開始下降，有的降到了非常低的水平，此時的心肌細胞仍然存活并可見搏動。
2.6 CVB3m病毒攻擊后心肌酶檢測結(jié)果 病毒接種后留1孔做空白對照，比較加病毒后心肌酶的變化。結(jié)果可見，病毒感染心肌細胞后，雖然沒有出現(xiàn)明顯的細胞病變，但是在病毒感染的情況下心肌酶的釋放會升高(表2)。表1 pNI4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后心肌酶測定結(jié)果(2批心肌細胞測定后取平均值)表2 病毒接種后心肌細胞酶測定(2批心肌細胞測定后取平均值)
2.7 RT-PCR擴增CVB3病毒5′-UTR的結(jié)果 為了證明心肌細胞中有CVB3存在，并且病毒處于持續(xù)感染狀態(tài)，吸取質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后和病毒感染后的心肌細胞的上清液，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄PCR擴增病毒的5′-UTR(Mastercycler gradient PCR)，結(jié)果如圖5所示，擴增到特異性大小的目的片斷，均為750 bp。
圖5 RT-PCR擴增CVB3病毒5′-UTR
1.CVB3m陽性對照;2.pNI4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后心肌細胞的上清液;3.CVB3m感染心肌細胞后的病毒上清液;4.陰性對照;M.DL 2 000 Marker
3 討 論
3.1 心肌細胞的原代培養(yǎng) 自1960 年Harary首次對Wistar 乳鼠的心肌細胞進行培養(yǎng)，并成功維持自發(fā)性搏動長達40天以來，國內(nèi)外諸多學(xué)者開展了離體心肌細胞的生長發(fā)育、生理、代謝、病理、藥理等方面的研究。本實驗的方法在前人方法的基礎(chǔ)上加以改進，體外分離和培養(yǎng)Balb/c乳鼠心肌細胞，并成功地獲得了很高的成活率和純度!
培養(yǎng)24 h后存活的心肌細胞即可貼壁生長，而破壞嚴重的心肌細胞難于貼壁而懸浮于培養(yǎng)液中并逐漸腫脹、破裂而死，此時更換培養(yǎng)液可進一步提高心肌細胞的存活率;利用actin免疫熒光檢測，證明我們獲得的Balb/c乳鼠原代心肌細胞純度達95%;心肌細胞搏動表明具有自律性的心肌細胞活性和狀態(tài)良好。
通過反復(fù)實驗我們發(fā)現(xiàn)：①最好選擇1～4天內(nèi)的新生鼠進行原代心肌細胞培養(yǎng)，尤其是3天內(nèi)培養(yǎng)更好;②嚴格無菌操作，打開胸腔后迅速摘取跳動的心臟，操作要熟練快捷;③利用BrdU對成纖維細胞的抑制作用，以及差速貼壁等方法，可以極大地純化心肌細胞;④消化過程是影響心肌細胞存活率的重要因素，胰蛋白酶可分解組織間質(zhì)的蛋白成分,但對肌細胞膜蛋白亦起較強的破壞作用[4]，故對其作用時間和濃度的要求較為嚴格。而每次實驗都可能有細微差別，所以應(yīng)結(jié)合肉眼觀察消化情況及時終止消化，不宜固定精確的消化時間。膠原酶可消化細胞間質(zhì)的膠原纖維以釋放細胞，作用較緩和，對細胞損傷較小;經(jīng)過多次重復(fù)實驗，我們認為單一使用胰蛋白酶消化對細胞損傷大，聯(lián)合使用膠原酶將膠原纖維充分消化后利于離心時細胞沉淀,提高心肌細胞存活率，細胞貼壁早，搏動出現(xiàn)亦早[5]。第1次消化時間不宜過長，否則會丟棄一些已消化下來的心肌細胞。終止消化后的消化產(chǎn)物應(yīng)立即離心，而后用培養(yǎng)液重懸以使受損的細胞盡早恢復(fù)。消化過程中反復(fù)吹打使酶與組織充分均勻接觸，使心肌細胞呈單個分散狀態(tài)從而減少消化次數(shù)和時間，提高細胞存活率。吹打不充分細胞團塊占5% 以上會大大降低心肌細胞的收獲率，并且從團塊中爬出來的成纖維細胞影響心肌細胞的生長和純度[6]。⑤培養(yǎng)液是維持細胞生存的基本條件，心肌細胞在偏酸性環(huán)境中(pH值7.0～7.2) 更利于生長，培養(yǎng)液儲存后pH值逐漸升高，最好現(xiàn)配現(xiàn)用�？股氐乃幮舛扰c毒效濃度接近，對細胞可造成損害，實驗中注意無菌操作可有效預(yù)防污染，故培養(yǎng)液盡量少加抗生素[7]醫(yī).學(xué)全.在.線網(wǎng)站www.gydjdsj.org.cn。
