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2.1 MTT實(shí)驗(yàn)
體外培養(yǎng)小鼠H22肝細(xì)胞癌株進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)，根據(jù)如下公式計算各組抑制率：抑制率(%)=[1-(實(shí)驗(yàn)組A均數(shù))/(對照組A均數(shù))]×100%。
如圖1所示，5Fu作為代表性的常用化療藥物對于體外培養(yǎng)的H22小鼠肝癌細(xì)胞具有顯著的殺傷效果，細(xì)胞增殖抑制率為52.8%，與3種免疫抑制劑相比有顯著性差異(P<0.05)。免疫抑制劑CsA和FK506對于H22小鼠肝癌細(xì)胞沒有顯著的抑制增殖的作用，而不同濃度的RPM有一定的抑制H22小鼠肝癌細(xì)胞增殖的作用。中、高濃度的RPM對H22小鼠肝癌細(xì)胞增殖的抑制率與CsA和FK506相比差異具有顯著性(P<0.05)。RPM中、高濃度(0.1 mg/L、1mg/L)組與低濃度(0.01mg/L)組相比抑制H22小鼠肝癌細(xì)胞增殖率差異有顯著性(P<0.05)，而中、高濃度組間相比無顯著性差異醫(yī).學(xué)全.在.線網(wǎng)站gydjdsj.org.cn。
2.2 細(xì)胞周期分析
體外培養(yǎng)對數(shù)生長的H22小鼠肝癌細(xì)胞株，在不同的免疫制劑和5Fu分別作用48h后，應(yīng)用流式細(xì)胞儀測定各組細(xì)胞的細(xì)胞周期分布變化，顯示不同濃度的RPM、CsA、FK506對于H22小鼠肝癌細(xì)胞周期的影響不同。采用流式細(xì)胞儀測定的各組細(xì)胞細(xì)胞周期變化見表1。表1 不同免疫抑制劑對H22小鼠肝癌細(xì)胞周期的影響(略)
RPM對H22小鼠肝癌細(xì)胞周期的影響表現(xiàn)為G0/G1期細(xì)胞數(shù)增多而S期細(xì)胞數(shù)減少。應(yīng)用不同濃度的RPM后H22小鼠肝癌細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞數(shù)由25.38%增加到30.89%～34.00%，而S期細(xì)胞數(shù)由42.00% 降至37.13%～32.20%，結(jié)果與對照組相比均具有顯著性差異(P<0.05)。RPM中、高濃度組與低濃度組相比對細(xì)胞周期的影響更顯著，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);而中、高濃度組間相比沒有顯著性差異。CsA和FK506作用下的H22小鼠肝癌細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞數(shù)減少，S期細(xì)胞數(shù)無明顯變化。不同濃度RPM對于H22細(xì)胞周期的影響與CsA和FK506相比具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。中、高濃度的RPM與5Fu對H22小鼠肝癌細(xì)胞周期的影響作用類似。
2.3 皮片存活情況
實(shí)驗(yàn)中小鼠C57BL/6→BALB/c異體皮膚移植模型建立成功，不同組間皮膚移植物存活時間表現(xiàn)出較大的差異性。根據(jù)移植皮片排斥時間的確定標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計分析各組皮片平均存活時間。當(dāng)受者小鼠給予不同劑量的RPM[1.5mg/(kg·d)，4.5mg/(kg·d)]、CsA[20mg/(kg·d)]、FK506[5mg/(kg·d)]灌胃后，移植物存活明顯延長，平均存活17.7～18.5d，與對照組(6.1～8.7d)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
2.4 腫瘤體積
對照組小鼠在接種H22小鼠肝癌細(xì)胞后一般在第5～7天在種植部位可以觸摸到一小米粒大小的瘤塊，第14天左右瘤塊一般即非常明顯。腫瘤種植到小鼠腹股溝皮下后第24天剖殺小鼠測定到的腫瘤體積，經(jīng)ANOVA方差分析各組數(shù)據(jù)方差齊并且組間有差異(P<0.05)。由圖2可見，各實(shí)驗(yàn)組間兩兩比較結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)劑量的CsA和FK506促進(jìn)了小鼠皮下移植瘤的生長，其腫瘤體積明顯較對照組增大(P<0.05)。而實(shí)驗(yàn)劑量的RPM在相同的條件下抑制了腫瘤的生長，瘤組織的體積較對照組小(P<0.05)。聯(lián)合應(yīng)用RPM和CsA或者FK506時，比單用CsA或者FK506時腫瘤體積明顯縮小，差異具有顯著性(P<0.05)。表2 不同免疫抑制劑對H22肝癌細(xì)胞培養(yǎng)液上清中VEGF濃度的影響(略)
2.5 ELISA法測定VEGF含量
依據(jù)試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品測定的結(jié)果繪制工作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用SSPS軟件進(jìn)行直線回歸分析，建立回歸方程：VEGF濃度=-28.598+(A值×196.746)。根據(jù)公式計算出各實(shí)驗(yàn)組的H22小鼠肝癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF濃度(表2)。在各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中，VEGF含量有差異，不同濃度的RPM作用下上清液中VEGF濃度顯著減低(P<0.05)。0.1mg/L FK506作用下上清液中VEGF濃度顯著減低(P<0.05)。1mg/L CsA作用下VEGF濃度略有提高。
體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的各組實(shí)驗(yàn)小鼠中，1.5mg/(kg·d)和4.5mg/(kg·d)的實(shí)驗(yàn)劑量RPM可降低荷瘤小鼠血清中的VEGF濃度(P<0.05)。5Fu治療組血清中的VEGF濃度也顯著降低，與對照組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。服用CsA的小鼠血清中的VEGF濃度較對照組升高(P<0.05)。FK506組VEGF濃度與對照組比較沒有明顯差異(表3)。表3 荷瘤小鼠血清中VEGF濃度的測定結(jié)果(略)
2.6 腫瘤組織內(nèi)MVD的測定
