醫(yī)學(xué)論文范文:rAAV2/1�睞crp30對動脈粥樣硬化的GK大鼠NF�拨蔅及黏附分子的影響

脂聯(lián)素(adiponectin, APN, Acrp30)是由脂肪細(xì)胞分泌的一種蛋白質(zhì)。研究證實脂聯(lián)素與胰島素抵抗密切相關(guān)，具有抗動脈粥樣硬化形成、抗炎癥和損傷后抗內(nèi)膜增生的特性。因此，脂聯(lián)素與糖尿病心血管疾病密切相關(guān)，脂聯(lián)素水平的下降是糖尿病及其心血管并發(fā)癥的一個重要的獨立危險因素[3��4]，補充脂聯(lián)素可能是對上述疾病的一種新的治療手段。轉(zhuǎn)基因技術(shù)是補充脂聯(lián)素的一種方法。在本課題前期研究中，我們課題組已成功構(gòu)建rAAV2/1�睞crp30載體[4]和糖尿病動脈粥樣硬化模型[5]。在本次研究中，我們將探討rAAV2/1�睞crp30對2型糖尿病動脈硬化模型大鼠黏附分子及NF�拨蔅的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6月齡雄性SPF級自發(fā)性糖尿病GK大鼠90只[購于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，質(zhì)量合格號：SCXK(滬)2006��0003]。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，選取隨機血糖值(羅氏全血葡萄糖測試儀)在11.1mmol/L以上的GK大鼠88只納入本實驗。按1只/籠飼養(yǎng)于獨立通氣籠具(IVC)系統(tǒng)內(nèi)。溫度(22±1)℃，濕度59%～61%，每天光照與黑暗時間各12h。所用籠具、飼料、墊料、飲水均高壓滅菌(15磅，20min)。實驗期間的灌胃、換水、添加飼料等操作均在超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行，由專人管理。

1.2 試劑和儀器 Rneasy Mini Kit：QIAGEN;ReverTra Ace�拨联睺M，F(xiàn)irst Strand cDNA Synthesis Kit：TOYOBO;Taq DNA聚合酶：美國Fermentas公司;dNTPs：美國Fermentas公司，DNA Marker DL 2000：TaKaRa;大鼠ICAM��1 ELISA試劑盒：美國ADL公司;瓊脂糖：西班牙進(jìn)口分裝;rAAV2/1�睞crp30：本課題組合成;空載腺相關(guān)病毒：本元正陽生物公司;H��7500透射電子顯微鏡：日本日立電子公司;AL��104電子天平：Mettler�睺oledo公司;超凈臺：BOXUN公司;PCR儀：Biometra;UNOⅡ水平電泳槽：北京君意東方儀器公司，JY�睸PC;電泳儀：北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心，DG�并箅p穩(wěn)數(shù)顯電泳儀;凝膠成像系統(tǒng)：柯達(dá)紫外顯相系統(tǒng)400W像素;酶標(biāo)分光儀：Quant Instuments inc公司。

1.3 動物建模 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機選取血糖值(怡成全血葡萄糖測試儀)在11.1mmol/L以上的GK大鼠，同時喂飼高脂飼料(普通飼料87.5%、精煉豬油10%、膽固醇2.0%、豬膽鹽0.3%，丙基硫氧嘧啶0.2%)。模型組在喂飼高脂飼料的基礎(chǔ)上加用10mg/(kg·d)一氧化氮合成酶(nitric oxide svnthase, NOS)抑制劑—N�蚕趸��睱��精氨酸甲酯(L�睳AME)灌胃。同時，Wistar組喂飼普通飼料，生理鹽水灌胃，連續(xù)8周[5]。

1.4 實驗動物分組及處理 除去造模失敗及死亡大鼠，將30只動脈硬化GK鼠納入本實驗。隨機數(shù)字法分為以下三個處理組：①模型1組(model group one, M1)：后肢肌肉注射生理鹽水;②模型2組(model group two, M2)：后肢肌肉注射空病毒rAAV2/1;③治療組(treatment group, T)：后肢肌肉注射rAAV2/1�睞crp30：1×1012mg/L。

1.5 標(biāo)本采集 光鏡和掃描電鏡樣本制備及觀察。

治療階段：實驗第0，8周，各組大鼠在禁食的基礎(chǔ)上，眶靜脈采血一次約2mL，低速離心機3300r/min離心后分離出血清。實驗第8周，在禁食的基礎(chǔ)上處死所有大鼠，用100mL/L的水合氯醛按3mL/kg腹腔注射麻醉大鼠。迅速打開胸腔，腹主動脈采血。低速離心機3300r/min離心后分離出血清，用于測定血脂及sICAM��1。將灌流針從心尖部位插入左心室至主動脈，快速灌注100mL生理鹽水，再用500mL生理鹽水經(jīng)心臟反復(fù)灌洗至發(fā)白，灌畢約30min，取主動脈弓下段2～3cm主動脈，用預(yù)冷的生理鹽水清洗，去除周圍結(jié)締組織，于-70℃冰箱保存。

1.6 指標(biāo)測定 ELISA法測血清sICAM��1，sVCAM��1。試劑盒購自美國ADL公司。RT�睵CR測主動脈NF�拨蔅p65 mRNA。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 各實驗獨立重復(fù)3次以上，重復(fù)性好。利用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量數(shù)值皆以±s表示。多樣本均數(shù)間采用單因數(shù)方差分析(one�瞱ay ANOVA)，方差不齊的采用TamhanecsT2統(tǒng)計方法檢驗，P<0.05表示差異有顯著性意義。

2 結(jié) 果

rAAV2/1�睞crp30對模型大鼠血清sICAM��1、sVCAM��1、主動脈NF�拨蔅p65 mRNA水平的影響顯示：治療8周后，T組sICAM��1，sVCAM��1水平較M1組及M2組明顯下降(P<0.05，見表1、表2)，T組治療前(0周)與治療后(8周)相比，sICAM��1、sVCAM��1水平明顯下降(P<0.05，表1、表2)。治療組T主動脈處NF�拨蔅p65 mRNA表達(dá)水平較M1組及M2組低(P<0.05，表3、圖1)。表1 各組大鼠血清可溶性細(xì)胞間黏附分子變化表2 各組大鼠血清可溶性血管細(xì)胞間黏附分子的變化表3 各組大鼠主動脈NF�拨蔅p65 mRNA表達(dá)水平的半定量比較

3 討 論

脂聯(lián)素是由脂肪細(xì)胞分泌的一種蛋白質(zhì)。研究證實脂聯(lián)素與胰島素抵抗密切相關(guān)，具有抗動脈粥樣硬化形成、抗炎癥和損傷后抗內(nèi)膜增生的特性。已有大量研究把脂聯(lián)素作為抗動脈粥樣硬化及抗炎的治療手段，將表達(dá)人脂聯(lián)素的腺病毒轉(zhuǎn)染給載脂蛋白E缺乏小鼠，14d后動脈竇處的動脈粥樣斑塊與對照組比較減小約30%，免疫組織化學(xué)顯示腺病毒攜帶的脂聯(lián)素轉(zhuǎn)移入粥樣硬化斑塊脂紋的泡沫細(xì)胞內(nèi)[6��7]。

A, M: marker; 1: system materials for internal reference (GAPDH); 2: model group one (M1); 3: model group two (M2); 4: treatment group (T)脂聯(lián)素基因敲除的大鼠出現(xiàn)血管炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致血管機械性損傷，新生血管壁增厚，血管平滑肌增生。此時如果補充脂聯(lián)素，那么這些情況就會改善[6]。脂聯(lián)素可以抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥及黏附，抑制泡沫細(xì)胞的形成，抑制血管平滑肌的增殖，抑制炎性因子的產(chǎn)生等，在動脈粥樣硬化形成的各個階段發(fā)揮其保護(hù)作用醫(yī).學(xué)全.在.線網(wǎng)站gydjdsj.org.cn。

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