 |
 |
1 材料與方法
1.1 主要試劑
RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自GIBCO公司，粉防己堿(Tet)購(gòu)自上海友思生物技術(shù)有限公司，根據(jù)文獻(xiàn)[7]以雙蒸水稀釋粉防己堿，配置濃度為0.1mmol/L的粉防己堿儲(chǔ)存液(0.1mol/L HCl助溶，0.1mol/L NaOH調(diào)整pH值至6.6～6.7)，4℃保存，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自Amresco公司，Annexin-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bipec公司，胰蛋白酶，二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自Sigma公司。
1.2 細(xì)胞株和細(xì)胞培養(yǎng)
宮頸癌HeLa細(xì)胞株由西安交通大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)研究分子中心提供。常規(guī)培養(yǎng)在含100mL/L胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37℃，50mL/L CO2飽和濕度，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合時(shí)，2.5g/L胰酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
1.3 MTT法檢測(cè)宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖抑制率
取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度5×104個(gè)/mL，以200μL/孔接種于96孔板，37℃，50mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，以粉防己堿終濃度為10、12.5、15、17.5、20、30μmol/L處理細(xì)胞。每個(gè)濃度設(shè)三個(gè)平行孔，并同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照和空白對(duì)照，分別于作用24、48、72h后每孔加入50mg/L的MTT溶液20μL，37℃孵育4h后，終止培養(yǎng)，小心吸去上清，每孔加入150μL DMSO，振蕩器震蕩10min，使結(jié)晶溶解完全，用酶標(biāo)儀在490nm處測(cè)量A值，按以下公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：抑制率(%)=(1-A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組)×100%。
1.4 實(shí)驗(yàn)分組
實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和處理組。對(duì)照組即正常生長(zhǎng)的HeLa細(xì)胞;處理組即給予粉防己堿處理的Hela細(xì)胞。
1.5 AnnexinV/PI雙染法流式細(xì)胞數(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡
以0μmol/L，15μmol/L粉防己堿處理細(xì)胞24h后，收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL。取1mL細(xì)胞，2000r/min，4℃，離心10min，棄上清。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞，400μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，密度為1×106個(gè)/mL。加5μL AnnexinV-FITC，輕柔混勻，在4～8℃避光孵育15min。再加10μL PI，在4～8℃避光孵育5min。于1h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
1.6 AnnexinV/PI雙染法激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化
將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HeLa細(xì)胞以1×105個(gè)/mL接種于預(yù)先置有蓋玻片的無(wú)菌6孔板中，終體積為2.5mL。待24h貼壁后，加入粉防己堿，使其在培養(yǎng)基中終濃度為15μmol/L，同時(shí)設(shè)不加藥的對(duì)照組。作用24h后，按AnnexinV-PI細(xì)胞凋亡試劑盒步驟染色，封片后立即用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察細(xì)胞并拍照。結(jié)果判定：正�；罴�(xì)胞AnnexinV和PI均為低染;凋亡早期的細(xì)胞膜完整，AnnexinV高染呈綠色，PI為低染;凋亡中晚期細(xì)胞則AnnexinV和PI均為高染，細(xì)胞膜呈綠色，細(xì)胞核呈紅色醫(yī).學(xué).全.在.線gydjdsj.org.cn。
1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3遍，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，并用SPSS13.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。MTT法試驗(yàn)結(jié)果用兩因素方差分析檢驗(yàn)，其余試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行兩獨(dú)立樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié) 果
2.1 粉防己堿對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞具有增殖抑制作用
