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1 材料和方法
1.1 細胞培養(yǎng)
大鼠腎小管導(dǎo)管上皮細胞株NRK-52EA(中科院細胞庫)，DMEM培養(yǎng)液(美國GIBCO公司),胎牛血清(Sigma公司),雙抗(青、鏈霉素各100 U/mL)。每周傳代2~3次。PTHrP、Ⅰ型膠原(美國Santa Cruz公司)，TGF-β1、MMP-2(英國ABCam公司),α-SMA(美國Dako公司),CM2H2DCF DA(美國Invitrogen 公司)
1.2 細胞分組與培養(yǎng)
NRK-52EA細胞分組為：⑴空白對照組(Control)：無糖培養(yǎng)基未進行干預(yù);⑵正常葡萄糖組：含5 mmoL/L葡萄糖，DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng);⑶高糖組：含25 mmol/L葡萄糖，DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng);⑷間歇性高糖組:分別應(yīng)用5 mmol/L葡萄糖(培養(yǎng)2 h)及25 mmol/L的DMEM培養(yǎng)基(培養(yǎng)3 h)交替培養(yǎng)，每天重復(fù)3次，夜間5 mmol/L葡萄糖維持過夜。所有分組均在37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)3 d。
1.3 Western blot 檢測蛋白表達
常規(guī)細胞裂解獲取蛋白，與預(yù)染蛋白Marker一起上樣,SDS-PAGE電離,電轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，TBST封閉，4 ℃過夜。然后與一抗分別按1∶100、1∶75、1∶125、1∶75及1∶50的比例室溫孵育90 min(α平滑肌肌動蛋白及Ⅰ型膠原4 ℃，過夜)，再分別與辣根過氧化物酶標(biāo)記相應(yīng)二抗(1∶1 000)室溫孵育45 min，TBST液洗膜，ECL顯色。采用Total Lab分析軟件對條帶進行密度掃描分析。
1.4 活性氧(ROS)檢測
各組細胞加入1 mmoL/L CM2H2DCF DA(終濃度為10 μmol/L)染色液10 μL,37 ℃避光孵育30 min,離心， PBS洗2次，重懸于含10%FCS的RPMI培養(yǎng)液中(1 mL)。酶標(biāo)儀檢測OD值,激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長528 nm。
1.5 統(tǒng)計學(xué)分析
采用SPSS 11.5軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，One-Way ANOVA-SNK法比較總體和組間差異。
2 結(jié)果
各組細胞TGF-β1、Ⅰ型膠原、MMP2、α-SMA以及PTHrP的表達見圖1，其表達強度見圖2，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高糖及間歇性高糖組中TGF-β1、Ⅰ型膠原、MMP-2、α-SMA以及PTHrP的表達均高于空白對照組及正常葡萄糖組(各組間P<0.05);并且間歇性高糖組TGF-β1、MMP2及α-SMA表達要高于高糖組(P<0.05)醫(yī).學(xué).全.在.線gydjdsj.org.cn。
圖1 TGF-β1、Ⅰ型膠原、MMP2、α-SMA以及PTHrP表達電泳圖(略)
不同葡萄糖條件下誘導(dǎo)NRK-52EA細胞株ROS含量影響,結(jié)果提示高糖及間歇性高糖均能顯著促進ROS含量水平升高(4800.00±360.56，5933.33±585.95)(P<0.01)，而間歇性高糖升高ROS作用顯著高于高糖組(P<0.05)�？瞻捉M(2036.67±212.21)和正常葡萄糖組(2070.00±257.62)均較前者低(P<0.01)
圖2 TGF-β1、Ⅰ型膠原、MMP2、α-SMA以及PTHrP表達含量圖(略)
3 討論
近年來公布的數(shù)項世界范圍大型糖尿病流行病學(xué)研究結(jié)果令人驚訝，早前英國糖尿病前瞻性研究(UKPDS)發(fā)現(xiàn)，單純降低HbA1c并不能減少死亡率;而近年來ACCORD研究結(jié)果更進一步發(fā)現(xiàn)積極血糖治療反而促進患者死亡率升高，該一系列研究結(jié)果與研究設(shè)想完全相斥。許多研究者認為，其主要原因可能由于積極血糖控制所導(dǎo)致血糖的波動致間歇性高血糖反復(fù)出現(xiàn)，比單純持續(xù)性高糖更加危害機體機能。糖尿病腎病是最常見的糖尿病慢性微血管并發(fā)癥，是糖尿病患者死亡的最重要因素之一，而所有糖尿病腎病病理轉(zhuǎn)歸即是腎臟纖維化。為此，本研究將從體外實驗去揭示間歇性高糖與腎臟纖維化之間可能的聯(lián)系，以進一步闡明間歇性高糖與持續(xù)性高糖間對機體危害的差異。
