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臨床醫(yī)學(xué)論文先天性小耳畸形的發(fā)病機(jī)制
EYA1(eyes absent 1)基因是 EYA家族中的一個(gè)重要成員，EYA 家族因其特有的C端編碼 271 個(gè)氨基酸的保守性較高的EYA結(jié)構(gòu)域(Eya Domain ED)而得名。EYA1基因編碼的蛋白質(zhì)對(duì)鰓弓和耳部的正常發(fā)育至關(guān)重要，且具有基因劑量效應(yīng)，需要達(dá)到一定閾值才能發(fā)揮正常功能。 人類中 EYA1基因發(fā)生突變或表達(dá)異�？蓪�(dǎo)致小耳畸形相關(guān)綜合癥鰓-耳綜合征（Panchio-oto syndrome, BOS)。Xu等(1999)報(bào)道 Eya1 + /－小鼠具有傳導(dǎo)聾的癥狀。近來表觀遺傳學(xué)的研究進(jìn)展為先天性小耳畸形病因?qū)W研究提供了新的思路。 表觀遺傳屬于基因外遺傳學(xué)修飾，其中主要的機(jī)制是DNA甲基化。本論文的研究自 2008年 1 月至2008年 12 月選擇 EYA1 為候選基因?qū)ο忍煨孕《位颊哌M(jìn)行 DNA 序列突變檢測，并應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分析技術(shù)檢測了先天性小耳畸形患者EYA1基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化情況，以探討先天性小耳畸形的發(fā)病機(jī)制。
1 研究對(duì)象
病例組：選擇非綜合癥型先天性小耳畸形患者 100 例。其中 98 例漢族，另有 1例滿族和1 例土家族（均為散發(fā)病例)。男71人，女 29 人，年齡范圍為 5～47 歲。包括 13 個(gè)家系（先證者和家系其他患病成員共31人)，散發(fā)患者69 人。100 例小耳畸形患者中包括小耳畸形伴耳前凹 34 例，小耳畸形伴耳前贅或副耳 22 例，小耳畸形伴腭裂 8例，小耳畸形伴面部不對(duì)稱21 例醫(yī).學(xué)全.在.線網(wǎng)站gydjdsj.org.cn，單純小耳畸形15例。對(duì)照組：沒有先天性耳部畸形的來我院進(jìn)行瘢痕修復(fù)或美容手術(shù)者50 人。
2 實(shí)驗(yàn)方法：
2.1 EYA1基因DNA序列突變檢測
抽取患者及對(duì)照組靜脈血，常規(guī)提取DNA，EYA1基因設(shè)計(jì)引物覆蓋了 EYA1基因所有編碼區(qū)和外顯子和內(nèi)含子交界處的引物 12 對(duì)。應(yīng)用50ul的 PCR 反應(yīng)體系，包含 100ng/ｕl 基因組 DNA 1ｕl，5U/ｕl Ampli Taq polymerase 2ｕl，10×PCR 緩沖液 5ｕl, 20uM dNTPs 1ｕl，10ｕmol/L primer 0.5ｕl，雙蒸去離子水補(bǔ)足致 35ｕl。PCR反應(yīng)條件如下： 94℃預(yù)變性5min； 94℃ 30s, 58℃ 45s, 72℃30s, 10 個(gè)循環(huán)； 94℃ 30s, 53℃45s, 72℃ 30s, 35個(gè)循環(huán)； 72℃充分延伸 5min； 4℃保存。 測序反應(yīng)產(chǎn)物純化后加甲酰胺10uL溶解，95℃變性5min后迅速放入冰中5min上樣，以 ABI 3100 Avant測序儀（ABI公司，美國)進(jìn)行測序。發(fā)現(xiàn)序列變異者進(jìn)行反向引物測序驗(yàn)證。應(yīng)用 Genetool 軟件進(jìn)行測定序列與標(biāo)準(zhǔn)序列的比對(duì)。
2.2 EYA1基因甲基化實(shí)驗(yàn)步驟：
2.2.1 引物設(shè)計(jì)
