病原生物學(xué)實驗指導(dǎo)
張育華 王光西
第一篇 細菌學(xué)總論 細菌的形態(tài)學(xué)觀察 內(nèi)容： 一、顯微鏡油鏡的使用和保護 二、活菌運動的觀察 三、細菌的基本形態(tài)和特殊結(jié)構(gòu)觀察 四、細菌涂片標(biāo)本的制作和革蘭氏染色 實驗一 顯微鏡油鏡的使用和保護 (useandcareofoilmicroscope) 微生物體積微小，必須借助于顯微鏡將其放大數(shù)百倍至數(shù)萬倍才能觀察到。因此，顯微鏡是認(rèn)識和研究微生物最重要和最基本的工具之一，掌握其使用方法是進行微生物研究的基本技能。在細菌的形態(tài)學(xué)檢查方面，以普通光學(xué)顯微鏡尤其是油鏡最常用。 【材料】 1、普通光學(xué)顯微鏡、香柏油、二甲苯、拭鏡紙。 2、細菌革蘭氏染色片。 【方法】 1、普通光學(xué)顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)(圖1) 2、油鏡的使用： (1)右手提住鏡臂，左手扶住鏡座，將顯微鏡平穩(wěn)地放于實驗臺上。勿將鏡臂彎曲傾斜，以免香柏油流散。 (2)轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換器，使低倍鏡對準(zhǔn)聚光器，將聚光器升到最高位置，用凹面鏡對光，完全打開光圈，使視野內(nèi)光線最強。 (3)將標(biāo)本固定在載物臺上，先在低倍鏡下找到標(biāo)本的適當(dāng)位置，再轉(zhuǎn)換為油鏡頭。油鏡頭上都有標(biāo)記，通常標(biāo)有90×或100×，刻有HI或oil等字樣，其前端有黑色、紅色或白色圓圈，透鏡孔徑較其它物鏡小。 (4)加一滴香柏油于標(biāo)本欲檢部位，用眼從油鏡頭側(cè)面觀察，同時調(diào)節(jié)粗調(diào)節(jié)器，使油鏡頭緩慢下降或載物臺緩緩上升，直至油鏡頭剛好浸于油內(nèi)。然后從目鏡觀察，緩慢調(diào)節(jié)粗調(diào)節(jié)器，直到出現(xiàn)模糊物象，再用細調(diào)節(jié)器將物象調(diào)至清晰。 3、顯微鏡的保護 (1)使用時應(yīng)小心和愛惜，勿隨意拆卸。 (2)保持物鏡和目鏡的清潔。每次使用完油鏡后，應(yīng)立即用滴有少許二甲苯的拭鏡紙擦凈鏡頭，再用干凈的拭鏡紙擦去鏡頭上的二甲苯，以防鏡片脫落。 (3)顯微鏡用畢，應(yīng)降下聚光器，并將物鏡轉(zhuǎn)開，使之呈八字形，蓋上鏡罩，放入鏡箱。 (4)宜將顯微鏡放置于干燥處，但又要防止陽光曝曬。 (5)勿用強酸、強堿、酒精、乙醚等擦拭顯微鏡。 【注意事項】 1、用油鏡觀察時，一定要注意標(biāo)本的正反面，標(biāo)本面應(yīng)向上。 2、載玻片的厚度應(yīng)適當(dāng)，不宜太厚。 3、一定要等標(biāo)本完全干燥后，才滴加香柏油。 4、滴加香柏油的量以1滴為宜。 5、鏡頭上陳舊的香柏油也可用二甲苯軟化。 附：香柏油的作用原理(圖2) 圖1 普通光學(xué)顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)1、目鏡 2、鏡筒 3、物鏡轉(zhuǎn)換器 4、物鏡 5、載物臺6、光圈 7、聚光器 8、反光鏡 9、鏡座 10、粗調(diào)節(jié)器11、細調(diào)節(jié)器 12、鏡臂 13、聚光器調(diào)節(jié)器
實驗二 活菌運動的觀察 （observationofmotilityoflivingbacteria) 鞭毛是細菌的運動器官，有鞭毛的細菌在液體培養(yǎng)基中作定向運動，因而有位置的移動；無鞭毛的細菌在液體培養(yǎng)基中，由于受到液體中其它分子不規(guī)則布朗運動的沖擊，只能在原處作不規(guī)則的分子顫動，而不發(fā)生位置的移動。 【材料】 1、普通變形桿菌、葡萄球菌8~12h的肉湯培養(yǎng)物。 2、載玻片、蓋玻片、凹玻片、凡士林、接種環(huán)、鑷子、普通光學(xué)顯微鏡。 【方法】 一、壓滴法 1、用接種環(huán)各取2～3環(huán)普通變形桿菌、葡萄球菌肉湯培養(yǎng)物，分別置于兩張載玻片的中央。 2、用鑷子挾住蓋玻片，使其一邊接觸菌液，然后緩緩放下，勿使菌液外溢，以不產(chǎn)生氣泡為宜。 3、將標(biāo)本置于高倍鏡下，觀察細菌運動情況。 1、取兩張凹玻片，凹窩四周涂少許凡士林。 2、各取一環(huán)普通變形桿菌、葡萄球菌肉湯培養(yǎng)物，分別置于兩張蓋玻片的中央。 3、反轉(zhuǎn)凹玻片，扣于蓋玻片上，使凹窩正對蓋玻片中央。輕壓之，使凡士林粘住蓋玻片后，再反轉(zhuǎn)，菌液則懸垂在凹窩中央。 4、置低倍鏡下找到懸滴的邊緣后，再用高倍鏡觀察。 【結(jié)果】 普通變形桿菌作定向運動，提示其有鞭毛；葡萄球菌作布朗運動，提示其無鞭毛。 【注意事項】 用上述兩種方法觀察時，均需適當(dāng)降低聚光器及縮小光圈，使視野光線較暗。 實驗三 細菌的基本形態(tài)和特殊結(jié)構(gòu)觀察 （observationofbacterialbasicshapeandspecialstructure) 各種細菌細胞在一定的環(huán)境條件下，都有其相對恒定的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。觀察細菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)，有助于細菌的鑒定、感染性疾病的診斷和治療。 細菌的基本形態(tài)有球形、桿狀和螺形三種。經(jīng)革蘭氏染色法染色后，可在顯微鏡下鑒別細菌的形態(tài)、大小、排列方式和染色性。細菌的特殊結(jié)構(gòu)包括莢膜、芽胞、鞭毛和菌毛，其中菌毛必須在電子顯微鏡下才能觀察到，其余三種也需要通過各自特殊的染色，才能在油鏡下查見。 【材料】 1、球菌示教片：葡萄球菌、鏈球菌、肺炎雙球菌、腦膜炎雙球菌、淋球菌革蘭氏染色片。 2、桿菌示教片：大腸桿菌革蘭氏染色片。 3、螺形菌示教片：水弧菌革蘭氏染色片。 4、鞭毛示教片：普通變形桿菌鞭毛染色片。 6、莢膜示教片：肺炎雙球菌莢膜染色片。 【方法】 l、在油鏡下觀察各種形態(tài)的細菌，比較它們在顏色、大小、形態(tài)和排列方式上的差別。 2、用油鏡觀察細菌的各種特殊結(jié)構(gòu)，注意鞭毛的數(shù)量和位置；芽胞的大小、形態(tài)和位置；莢膜的厚度、顏色。 【結(jié)果】 請將觀察結(jié)果以繪圖方式記錄如下： 實驗四 細菌涂片標(biāo)本的制作和革蘭氏染色 （preparationofbacterialsampleandgramstain) 細菌體積微小，為五色半透明體，若不經(jīng)染色直接在顯微鏡下觀察，僅能初略觀察其大小和形態(tài)。若要識別細菌的各種結(jié)構(gòu)，則必須進行染色。細菌的染色方法有多種，其中革蘭氏染色是應(yīng)用最廣泛的細菌染色法。用這種方法可以將所有的細菌區(qū)分為革蘭氏陽性。 菌和革蘭氏陰性菌兩類，對于鑒別細菌、研究細菌的致病性和選用抗菌藥物均有重要價值。 革蘭氏染色法的原理目前仍未完全闡明，大多數(shù)學(xué)者傾向于細胞壁學(xué)說。該學(xué)說認(rèn)為：革蘭氏陽性菌細胞壁結(jié)構(gòu)比較致密，肽聚糖層厚，脂質(zhì)含量少，乙醇不易透入，反而可使細胞壁脫水而形成一道屏障，阻止染料向細胞外滲出，細菌仍保留結(jié)晶紫初染的紫色；革蘭氏陰性菌細胞壁疏松，肽聚糖層很薄，而外膜、脂蛋白、脂多糖均含有大量脂質(zhì)，易被乙醇溶解，增加了細胞的通透性，使結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物易于滲出，細胞脫色后經(jīng)復(fù)紅復(fù)染，著上紅色。 【材料】 1、大腸桿菌、葡萄球菌18～24h培養(yǎng)物。 2、結(jié)晶紫染液、盧戈氏碘液、石炭酸復(fù)紅稀釋液、95％乙醇。 3、載玻片、接種環(huán)、生理鹽水、酒精燈等。 【方法】 1、細菌涂片標(biāo)本的制備：涂片干燥固定。 (1)涂片：用接種環(huán)取l～2環(huán)生理鹽水置于一張潔凈載玻片中央。將接種環(huán)滅菌后，刮取少許菌苔于生理鹽水中碾磨成乳濁狀，并涂成直徑約1cm2的菌膜(若用細菌的液體培養(yǎng)物制片，可直接取材涂片，不用加生理鹽水)。 (2)干燥：最好自然干燥。必要時也可將涂片的標(biāo)本面向上，在離酒精燈火焰較遠的高空處小心烘干。切勿靠火焰太近，以免將標(biāo)本烤枯，細菌變形，影響結(jié)果觀察。 (3)固定：手執(zhí)載玻片一端，標(biāo)本面向上，在酒精燈火焰外層上以鐘擺速度來回通過三次，目的是殺死細菌，匣菌體與玻片粘附更牢固，染料更容易進入菌體(圖4)。 2、革蘭氏染色： (1)初染：滴加1～2滴結(jié)晶紫染液于標(biāo)本菌膜上，1min后，用水沖洗，并傾去玻片上的余水。 (2)媒染：加盧戈氏碘液l～2滴于菌膜上，1min后，用水沖洗，并傾去玻片上的余水。 (3)脫色：加95％乙醇1～2滴于菌膜上，輕輕晃動玻片約30秒鐘，然后用水沖洗，并傾去玻片上的余水。 (4)復(fù)染：加石炭酸復(fù)紅稀釋液1～2滴于菌膜上，用水沖洗，并傾去玻片上的余水。待標(biāo)本干燥后，用油鏡觀察。 【結(jié)果】 葡萄球菌是革蘭氏陽性菌，被染成紫色；大腸桿菌是革蘭氏陰性菌，被染為紅色。 【注意事項】 1、細菌涂片時，菌膜應(yīng)薄而均勻。 2、在染色過程中，應(yīng)該用細小水流沖洗，且水流不宜直接沖在菌膜上。 3、革蘭氏染色的結(jié)果受多種因素影響，如細菌的培養(yǎng)時間、染色技術(shù)等。染色中應(yīng)特別注意掌握好脫色的時間過長或過短均會影響染色結(jié)果。氣溫較高時，脫色時間可稍短；氣溫較低時，脫色時間可稍長。 【思考題】 1、掌握細菌各種特殊結(jié)構(gòu)的特點有何意義? 2、細菌涂片標(biāo)本的菌膜過厚，對革蘭氏染色的結(jié)果有什么影響? 3、經(jīng)革蘭氏染色后，葡萄球菌若被染為紅色，試分析其原因。 細菌的生長繁殖和代謝 內(nèi)容： 一、基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備 二、細菌的接種法和生長現(xiàn)象觀察 三、細菌代謝產(chǎn)物的檢查 第二篇 細菌各論實驗 球菌是細菌中的一個大類，根據(jù)染色性不同分為革蘭氏陽性球菌與革蘭氏陰性球菌。革蘭氏陽性病原性球菌主要有葡萄球菌、鏈球菌、肺炎鏈球菌。革蘭氏陰性病原性球菌主要有腦膜炎球菌和淋球菌。 內(nèi)容： 一、病原性球菌的形態(tài)特征及培養(yǎng)特性 二、膿汁標(biāo)本病原菌的分離鑒定 三、病原性球菌幾種常用的生化檢查方法及致病性測定 病原性球菌 實驗十六 病原性球菌的形態(tài)特征及培養(yǎng)特性 目的要求： 掌握病原性葡萄球菌、鏈球菌、肺炎鏈球菌、腦住院醫(yī)師膜炎球菌的形態(tài)特征、染色性及菌落特征。 【材料】 1、葡萄球菌、鏈球菌、腦膜炎球菌和淋球菌革蘭氏染色示教片，肺炎鏈球菌莢膜染色示教片。 2、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌在普通平板上18-24h培養(yǎng)物，金黃色葡萄球菌、甲型、乙型溶血性鏈球菌、肺炎鏈球菌在血平板上18～24h培養(yǎng)物。 【方法】 1、鏡下觀察葡萄球菌、鏈球菌、肺炎鏈球菌、腦膜炎球菌和淋球菌，注意他們的形態(tài)、大小、染色性和排列方式，仔細觀察肺炎鏈球菌的特殊結(jié)構(gòu)(莢膜)。 2、觀察幾種葡萄球菌在普通平板上形成的色素顏色，觀察金黃色葡萄球菌，甲型、乙型溶血性鏈球菌，肺炎鏈球菌在血平板上的生長現(xiàn)象，主要從菌落大小、顏色、有無溶血現(xiàn)象三個方面觀察。 【結(jié)果】 l、形態(tài)及染色觀察：見表 2、菌落觀察： (1)金黃色、表皮、腐生葡萄球菌菌落均為圓形、隆起、濕潤、光滑、邊緣整齊、不透明的中等大小菌落，各自形成金黃色、白色、檸檬色脂溶性色素，培養(yǎng)基不著色，金黃色葡萄球菌菌落周圍有五色透明較寬的完全溶血環(huán)。 (2)鏈球菌為灰白色、表面光滑、邊緣整齊的細小菌落，甲型溶血性鏈球菌菌落周圍形成草綠色半透明狹窄的溶血環(huán)，乙型溶血性鏈球菌菌落周圍形成五色透明較寬的溶血環(huán)，丙型鏈球菌無溶血環(huán)。 (3)肺炎鏈球菌菌落圓形，光滑，中心凹陷，邊緣隆起，半透明，針尖大小，菌落周圍有草綠色半透明狹窄的溶血環(huán)。 表6 幾種病原性球菌的菌體形態(tài)及染色性
實驗十七 膿汁標(biāo)本病原菌的分離鑒定 從臨床標(biāo)本中，根據(jù)各種化膿性球菌不同的生物學(xué)特性，通過直接涂片鏡檢、分離培養(yǎng)、觀察生化反應(yīng)等方法，可鑒定出未知的化膿性球菌，不僅可提供化膿性感染疾病臨床診斷的依據(jù)，而且可進行藥物敏感試驗，為臨床選用有效的抗菌藥物提供參考。本實驗主要以葡萄球菌、鏈球菌、肺炎鏈球菌、腦膜炎球菌和淋球菌為檢查對象。 目的與要求 熟悉病原性球菌的分離、鑒定方法。 【材料與方法】 l、標(biāo)本采集和處理 (1)膿標(biāo)本：用無菌棉簽，蘸取患處深部膿液少許，置入無菌空試管內(nèi)，送檢。 (2)痰標(biāo)本：用消毒過的容器收集病人痰液，以無菌棉簽挑取病人膿稠痰塊，置入無菌空試管內(nèi)，送檢。 (3)咽喉部標(biāo)本：令病人把口張大，用壓舌板壓住舌根部，用無菌棉簽，迅速蘸取咽喉部分泌物，置入無菌空試管內(nèi)，送檢。 (4)血標(biāo)本：疑為化膿性球菌敗血癥患者，在嚴(yán)格無菌操作下，靜脈釆血5-6ml，床旁直接加入50m1的肉湯瓶內(nèi)，立即搖勻，送檢。 (5)腦脊液標(biāo)本：需做腦脊液細菌學(xué)檢驗的病人，在嚴(yán)格無菌操作下，做腰椎穿刺，取腦脊液置入無菌容器內(nèi)，立即送檢。 (6)尿道、陰道分泌物標(biāo)本：對淋病可疑患者，男性可從尿道取材，取材時無菌棉簽應(yīng)進入尿道1-2cm，如剛排尿，應(yīng)等待1小時左右。女性則可從宮頸口取分泌物，當(dāng)無菌棉簽插入宮頸口后應(yīng)稍等片刻，再旋轉(zhuǎn)1～2分鐘拿出。取材后應(yīng)立即送檢，不可放置冰箱。 2、分離與鑒定 根據(jù)檢查的要求和目的，按下圖所示進行分離鑒定。
【結(jié)果】 通過上述檢查，得出標(biāo)本中化膿性球菌的種類和細菌藥物敏感試驗的結(jié)果。 【注意事項】 1、上面只表明一般的檢查原則，在實際檢查中，還須根據(jù)臨床提供的可能診斷，做定向的檢查。 2、若疑為流腦或淋病患者，其標(biāo)本送檢時，要注意保溫，所用的培養(yǎng)基要提前放人孵箱內(nèi)預(yù)溫。 3、在檢查腦膜炎球菌或淋球菌時，如需做細菌培養(yǎng)，應(yīng)選用巧克力血瓊脂平板。 實驗十八 病原性球菌的幾種常用生化檢查方法及致病性的測定 目的與要求 掌握血漿凝固酶試驗(玻片法)，熟悉膽汁溶菌試驗，了解抗鏈球菌“O”溶血素試驗。 (一)血漿凝固酶試驗 大多數(shù)致病性葡萄球菌能產(chǎn)生血漿凝固酶，使人或動物血漿發(fā)生凝固。因此，測定血漿凝固酶的有無是鑒定葡萄球菌致病性的重要依據(jù)。血漿凝固酶分為結(jié)合于菌體的結(jié)合凝固酶和分泌至菌體外的游離凝固酶，可分別由玻片法和試管法測定。 [玻片法] 【材料】 1、金黃色、表皮葡萄球菌瓊脂斜面培養(yǎng)物。 2、兔血漿、生理鹽水。 3、玻片、接種環(huán)等。 【方法】 1、將玻片分為3格，用接種環(huán)分別取2～3環(huán)生理鹽水。 2、從瓊脂斜面挑取金黃色葡萄球菌，分別混懸于第1格和第3格內(nèi)，挑取表皮葡萄球菌，混懸于第2格。 3、在第1、2格分別加入兔血漿各一環(huán)并混勻，第3格不加兔血漿。靜止片刻，觀察結(jié)果。 【結(jié)果】 第3格和第2格不凝聚；第1格中金黃色葡萄球菌凝集成塊，即判定為血漿凝固酶陽性。 表7 血漿凝固酶試驗
【試管法】 【材料】 1、金黃色、表皮葡萄球菌瓊脂斜面培養(yǎng)物。 2、兔血漿、生理鹽水。 3、1ml刻度吸管、小試管。 【方法】 l、稀釋血漿：將生理鹽水與兔血漿作l:4稀釋，然后分別吸取0.5ml置于2只小試管內(nèi)。 2、從斜面上分別挑取金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌各數(shù)環(huán)于血漿管中，制成濃厚的懸液。置37℃水浴30分鐘，觀察結(jié)果。 【結(jié)果】 接種金黃色葡萄球菌的管中血漿凝固，接種表皮葡萄球菌的管中血漿不凝固，前者為凝固酶試驗陽性，后者為凝固酶試驗陰性。 (二)膽汁溶菌試驗 由于肺炎鏈球菌能產(chǎn)生自溶酶，可使細菌本身發(fā)生溶解。而自溶酶可被膽汁、膽鹽或其他表面活性物質(zhì)激活而進一步增加其活性，加速菌體的溶解。憑借此試驗可鑒別肺炎鏈球菌與甲型溶血性鏈球菌。 l、肺炎鏈球菌菌液，甲型溶血性鏈球菌菌液。 2、10％去氧膽酸鈉溶液，生理鹽水。 3、水浴箱、吸管、試管等。 【方法】 1、按表排列試管，并加入各成分。 表8 膽汁溶菌試驗 單位:ml
【結(jié)果】 1號管由混濁變清亮，表明細菌被溶解，即為膽汁溶菌試驗陽性。其余各管無變化，為陰性。 【注意事項】 1、去氧膽酸鈉在酸性環(huán)境下易沉淀，故菌液應(yīng)是弱堿性。 2、粗糙型或死的肺炎鏈球菌，可以不表現(xiàn)出膽溶現(xiàn)象。 3、膽鹽溶菌過程，是加速自然溶菌的過程，膽鹽本身沒有直接的溶菌作用。 4、此試驗為定性試驗，故所用菌液以肉眼可見混濁即可。 (三)抗鏈球菌溶血素“O”試驗 乙型溶血性鏈球菌產(chǎn)生的溶血素“O”(strepto1ysino,SLO)，為含有～SH基的蛋白質(zhì)，在還原狀態(tài)其溶血性活躍，遇氧時，～SH基被氧化為～S～S～基，失去溶血活性。由于SLO有很強的免疫原性，多數(shù)人感染該菌后，血清中出現(xiàn)較高水平的抗O抗體，并可至病愈后數(shù)月至數(shù)年才消失。因此，測定患者血清中抗O抗體的效價，常作為風(fēng)濕熱及其活動性的輔助診斷。 在體外，以還原溶血素為抗原與待檢血清混合后觀察結(jié)果，如血清中有相應(yīng)抗體，則可中和溶血素使其失去溶血活性，再加紅細胞時不溶血，呈現(xiàn)抗“O”陽性反應(yīng)，反之，則為陰性。 【材料】 1、被檢血清(加熱56℃30分鐘滅活，用生理鹽水稀釋為1:200)、鏈球菌溶血素、還原劑、生理鹽水、2％兔紅細胞。 2、小試管、吸管、水浴箱等。 【方法】 1、配制還原溶血素：取鏈球菌溶血素片劑及還原劑各一片，置小試管中，加生理鹽水1ml，用玻璃棒攪碎，放室溫15分鐘使溶血素還原，最后補充生理鹽水7ml，制成還原溶血素“O”。 2、取5支小試管，分別編號，按表進行操作。 表9 抗“O”實驗操作表 單位：ml
【結(jié)果】 觀察結(jié)果時，應(yīng)輕輕取出試管(勿搖動)，對光檢查有無溶血現(xiàn)象(溶血者上清液呈透明紅色，不溶血者混濁)。完全不溶血的血清最高稀釋度即為抗鏈球菌溶血素“O”的效價。一般正常人血清效價在I：250以內(nèi)，大于l：400有診斷意義，表明機體近期感染過溶血性鏈球菌。風(fēng)濕熱、腎小球腎炎等鏈球菌感染性疾病，效價逐步增高提示為活動期，反之則為緩解期。 【思考題】 1、說明幾種病原性球菌的菌體形態(tài)及特征。 2、為什么對葡萄球菌的細菌學(xué)檢測要做致病性鑒定?有哪些方法?最常用的是哪種方法?
第三篇 其它微生物及病毒實驗 螺旋體的檢查 內(nèi)容： 一、鉤端螺旋體暗視野顯微鏡觀察 二、鉤端螺旋體凝集溶解試驗 三、梅毒螺旋體鍍銀染色片觀察 四、梅毒血清學(xué)～～RPR試驗 五、口腔標(biāo)本涂片剛果紅染色檢查奮森氏螺旋體 目的要求 熟悉幾種主要原性螺旋體的形態(tài)特征及染色性。 螺旋體是一類細長、柔軟、彎曲呈螺旋狀、運動活潑、革蘭氏陰性的原核細胞型微生物。螺旋體種類很多，對人致病的主要有鉤端螺旋體、梅毒螺旋體和回歸熱螺旋體。 實驗三十三 鉤端螺旋體形態(tài)觀察 (一)鉤端螺旋體活標(biāo)本暗視野觀察 【材料】鉤端螺旋體培養(yǎng)物、載玻片、蓋玻片、暗視野顯微鏡、暗視野顯微鏡燈源、酒精燈、接種環(huán)。 【方法】取鉤體培養(yǎng)液滴于載玻片上，覆以蓋玻片。在暗視野顯微鏡聚光器上加l滴香柏油，使載玻片背面與香柏油接觸，低倍鏡下調(diào)節(jié)反光鏡，使光集中在聚光器上。調(diào)清楚視野后，再換高倍鏡觀察。可在黑色背景中清楚地看到閃爍光亮的螺旋體，運動活潑，同時具有特殊運動方式，如同原蟲一樣的蠕動、彎曲成角、旋轉(zhuǎn)運動、一端或兩端彎曲呈鉤狀。 附：暗視野顯微鏡原理 暗視野顯微鏡是將普通顯微鏡的聚光器換成一個暗視野聚光器，該聚光器中央有一個黑色擋光板，光線不能直接進入物鏡頭，而只能從擋光板周邊縫隙折射到載玻片上。當(dāng)光線通過載玻片上的標(biāo)本時，由于標(biāo)本與周圍物體折光率不同而引起光的折射，使一部分光線進入物鏡頭，從而可在黑色的背 (二)固定標(biāo)本片（宜薄)，F(xiàn)ontana氏鍍銀染色法觀察： (1)鉤體標(biāo)本涂片(宜薄)，自然干燥(不用火焰固定)。 (2)滴加固定液(冰醋酸1ml，甲醛2ml，蒸餾水10m1，作用1～2min)。 (3)用無水乙醇洗滌。 (4)滴加媒染液(鞣酸5g，石炭酸1g，蒸餾水100m1)2～3滴，加溫至發(fā)生蒸汽，染30sec，水洗： (5)滴加氨銀溶液(5％硝酸銀液，逐滴加入10％氨液，至所產(chǎn)生的棕色沉淀物經(jīng)輕輕搖動溶解為止)，并加熱使產(chǎn)生蒸汽，染30sec，水洗。干后用加拿大樹校膠片，鏡檢。 【結(jié)果】 背景為淡棕色，鉤體染成棕褐色，一端或兩端有鉤，但螺旋不清楚。 實驗三十四 凝集溶解試驗 凝集溶解試驗是一種血清學(xué)反應(yīng)，用來測定病人血清的抗體或用已知血清鑒定所分離到的鉤端螺旋體型別。但不同于細菌凝集反應(yīng)，鉤端螺旋體遇到相應(yīng)抗體可發(fā)生產(chǎn)凝集，但抗體濃度大時則可溶菌，故稱為凝集溶解反應(yīng)。 1、在有機玻璃凹孔板上，按表順序加入各成分量后搖勻，置37℃2h。 表12 凝集溶解試驗
2、2h后，從各孔中分別吸取1滴于載玻片上，覆以蓋玻片，在商視野顯微鏡下觀察。 3、結(jié)果判定 “++++”：幾乎全部鉤體發(fā)生凝集，偶見極少數(shù)正常鉤體存在。 “+++”：75％以上鉤體凝集，凝集者呈蜘蛛狀，見少數(shù)游離。 “++”：50％以上鉤體凝集呈現(xiàn)蜘蛛狀，約有半數(shù)不凝集。 “+”：25％以上鉤體凝集呈現(xiàn)小蜘蛛狀，大多數(shù)游離運動活潑。 “～”：鉤體正常分散存在。 無凝集現(xiàn)象生理鹽水對照：全部鉤體正常，運動活動，分散存在。 凝溶試驗通常以出現(xiàn)“++”的最高稀釋度為該血清最終效價，效價1：400以上才有診斷意義。 實驗三十五 梅毒螺旋體形態(tài)觀察 （一)梅毒螺旋鍍銀染色片示教，油鏡下的背景為淡黃褐色，螺旋體呈棕褐色至棕黑色。 (二)梅毒血清試驗～～RPR試驗 RPR試驗，即快速血漿反應(yīng)素卡片實驗(rapidplasmareagincardtest)，是一種正相間接凝集反應(yīng)。將患者廁清與吸附于活性炭的心磷脂～膽固醇的類脂質(zhì)抗原混合，出現(xiàn)不同程度的黑色素凝集顆�；蛐跗瑸殛栃浴� 【方法】 定性試驗：取待檢血清50pL，加至卡片上，并擴大到整個圓圈。每份血清上滴加RPR抗原]滴(約50цL)，旋轉(zhuǎn)搖動8min，立即用肉眼觀察結(jié)果。 定量試驗：定性試驗陽性者，可在RPR卡片上將血清作1:2-1:64稀釋后，按定性方法操作進行定量試驗。 結(jié)果判定： 定性：陰性標(biāo)本反應(yīng)液中不出現(xiàn)黑色素凝集顆粒。陽性標(biāo)本反應(yīng)液中可見明顯黑色素效集顆�；蛐跗� 定量：以肉眼為觀察標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)顆粒或絮片的大小，記錄“+”～”++++”或“～”： “++++”：明顯塊狀沉淀，溶液明亮。 “+++”：呈現(xiàn)大顆粒，溶液明亮。 “++”：呈現(xiàn)小顆粒，溶液明亮。 “+”：僅顯細小顆粒，溶液混濁。 “±”：僅呈輕微絮狀，液體混濁，為可疑反應(yīng)。 “～”：清晰無顆粒。 抗原對照應(yīng)呈現(xiàn)乳光，完全液化。
第四篇 寄生蟲學(xué)實驗 實驗四十六 溶組織內(nèi)阿米巴(Entamoeba histolytica) 目的要求： 1、掌握溶組織內(nèi)阿米巴的各期形態(tài)特點。 2、掌握碘液染色法檢查溶組織內(nèi)阿米巴包囊的方法。 3、認(rèn)識非致病阿米巴與溶組織內(nèi)阿米巴的區(qū)別特點。 實驗內(nèi)容： 一、自學(xué)標(biāo)本： 1、活的阿米巴滋養(yǎng)體：用生理鹽水直接涂片法作涂片，立即用低倍鏡尋找。查見不規(guī)則能運動的滋養(yǎng)體，然后換高倍鏡，仔細觀察其阿米巴運動，偽足的特點。 2、溶組織內(nèi)阿米巴包囊：以碘染色后，低倍鏡尋找，高倍鏡觀察構(gòu)造，包囊為黃綠色的圓形小體，囊壁，核膜與核仁均著色，糖原塊呈棕黃色，因折光的原因可發(fā)亮或暗色，包囊的擬染色體不著色。注意觀察溶組織內(nèi)阿米巴包囊的大小、形狀、顏色、核和糖原塊等構(gòu)造。 二、示教標(biāo)本：鐵蘇木素染色標(biāo)本，以油鏡觀察阿米巴的形態(tài)構(gòu)造，要觀察到 所有的構(gòu)造，可一邊仔細調(diào)節(jié)細螺旋，一邊觀察。 1、溶組織內(nèi)阿米巴大滋養(yǎng)體：注意大小，內(nèi)、外質(zhì)區(qū)別明顯，內(nèi)質(zhì)中可見被吞噬的紅細胞，體積較小，被染成黑色。滋養(yǎng)體有核一個，圓形、呈車輪狀，核膜內(nèi)緣有一層細而排列整齊的染色質(zhì)粒。核仁一個，小點狀，居中。 2、溶組織內(nèi)阿米巴包囊：注意大小、形狀，核的數(shù)目和構(gòu)造，擬染色醫(yī)學(xué)全.在線gydjdsj.org.cn體形狀，有無糖原塊。 3、與其它非致病阿米巴的形態(tài)鑒別，如結(jié)腸內(nèi)阿米巴包囊。 三、技術(shù)操作 碘液染色法 (1)滴一滴碘液于載玻片上，以竹簽蘸取糞便少許，混合涂布于碘液中(或在碘液附近滴一滴糞便沉淀液)然后以蓋玻片的棱角調(diào)勻，以此蓋玻片蓋于液體上。 (2)作好的片子放于低倍鏡下仔細尋找包囊，找到后，再換高倍鏡觀察結(jié)構(gòu)。 注意事項： 1、請勿用油鏡觀察碘液染色的片子。 2、在觀察碘液染色標(biāo)本時，載物臺要放平，光線稍強，并須耐心尋找，尤其較小的包囊更須細心。 3、將涂用的竹簽和用后的玻片，放在指定的地方。 作業(yè)： 繪圖：碘染色的溶組織內(nèi)阿米巴包囊，注明結(jié)構(gòu)。 思考題： 1、對溶組織內(nèi)阿米巴急性患者和帶蟲者的糞便各采取何方法檢查病原體? 2、檢查阿米巴滋養(yǎng)體時應(yīng)注意什么問題? 實驗四十七 杜氏利什曼原蟲(Leishmania donovani) 目的要求： 1、掌握杜氏利什曼原蟲無鞭毛體的形態(tài)特征。 3、觀察本蟲前鞭毛體的形態(tài)及傳播利什曼病的中華白蛉。 實驗內(nèi)容： 一、自學(xué)標(biāo)本：無鞭毛體(利杜體)：患者骨髓穿刺液染色涂片或人工感染的田鼠肝、脾印片，經(jīng)吉氏或瑞氏染液染色制片。因為原蟲甚小，故直接在油鏡下尋找，并觀察其結(jié)構(gòu)。注意大小(和紅細胞比較)，細胞顏色，核和動基體的位置變化很大，有時只能看到核，而看不到動基體，有時核偏于一側(cè)或一端，而動基體居于中央。 注意事項：被侵襲的網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞由于膨脹過大，在涂片時往往破裂，而利杜體散于血漿中。要與血小板相區(qū)別，利杜體較大，細胞質(zhì)包有較規(guī)則的膜，而血小板較小一般不超過2微米，常呈星形或多角形，成群分布。 二、示教標(biāo)本 1、前鞭毛體：顯微鏡下觀察，注意大小，形狀，鞭毛，動基體的位置以及多數(shù)蟲體集合而呈菊花形的排列。 2、中華白蛉Phlebotomus Chinensis：約為蚊子的1／3大小，駝背狀，全身密生細毛，灰黃色(詳見教材白蛉部分)。 作業(yè)： 以彩色筆繪圖，無鞭毛體(利杜體)，標(biāo)明結(jié)構(gòu)。 思考題： 診斷利什曼病應(yīng)從那些器官組織取材?怎樣識別涂片中的無鞭毛體? 實驗四十八 藍氏賈第鞭毛蟲(Giardia lamblia) 目的要求： 觀察藍氏賈第鞭毛蟲的滋養(yǎng)體和包囊。 實驗內(nèi)容： 一、自學(xué)標(biāo)本： 包囊：碘液染色(方法見阿米巴實驗技術(shù)操作)，低倍鏡找到后，高倍鏡下觀察其大小，活意形狀，軸柱，鞭毛及核的數(shù)目等。 二、示教標(biāo)本： 1、滋養(yǎng)體(吉氏染色，油鏡觀察)：注意大小，形態(tài)，核和鞭毛數(shù)目等構(gòu)造。 2、包囊(鐵蘇木素染色，油鏡觀察)：注意大小，形狀，軸柱，鞭毛及核的數(shù)目。 作業(yè)：繪藍氏賈第鞭毛蟲包囊圖(碘染)，并標(biāo)明結(jié)構(gòu)。 思考題： 藍氏賈第鞭毛蟲滋養(yǎng)體和包囊的形態(tài)特征有哪些? 實驗四十九 陰道毛滴蟲（Trichomonas Vaginalis) 目的要求：認(rèn)識陰道毛滴蟲滋養(yǎng)體的形態(tài)及活動特點。 實驗內(nèi)容： 一、自學(xué)標(biāo)本： 陰道毛滴蟲滋養(yǎng)體(吉氏染色或鐵蘇木素染色標(biāo)本)：油鏡下觀察，可見蟲體的構(gòu)造。 二、示教標(biāo)本 1、活的陰道毛滴蟲滋養(yǎng)體：高倍鏡下觀察，在懸滴液內(nèi)可以看到梨狀的透明蟲體，運動較活潑，前鞭毛不時地在擺動。注意其運動情況，因在臨床檢驗多觀察此種活標(biāo)本。 2、陰道毛滴蟲滋養(yǎng)體，吉氏染色或鐵蘇木素染色標(biāo)本。 作業(yè)： 繪陰道毛滴蟲滋養(yǎng)體圖，并標(biāo)明結(jié)構(gòu) 思考題： 1滴蟲性陰道炎的發(fā)病原因是什么? 2檢查陰道毛滴蟲的方法有哪幾種?
實驗五十 瘧原蟲(Plasmodium spp) 目的要求： 掌握間日瘧原蟲和惡性瘧原蟲在人體紅細胞內(nèi)的各期形態(tài)。 掌握薄血膜的推片，染色(用吉氏或瑞氏染液染色)操作 實驗內(nèi)容： 一、自學(xué)標(biāo)本： 間日瘧原蟲薄血片(吉氏染色)：觀察方法：將有血膜的一面朝上，置于低倍鏡下，在血膜末梢紅細胞分布均勻處加鏡油一滴，使油鏡頭浸入油中；調(diào)節(jié)光亮度取得較強的光線；慢慢旋轉(zhuǎn)螺旋細調(diào)節(jié)，看清紅細胞后，按順序觀察。在紅細胞內(nèi)找瘧原蟲，一般在環(huán)狀體期以后，被寄生的紅細胞開始逐漸漲大，褪色，而且出現(xiàn)紅色薛氏小點。 (1)環(huán)狀體：注意大小，細胞質(zhì)與核的特點。 (2)大滋養(yǎng)體：注意蟲體增大，細胞質(zhì)和核的變化，有否瘧色素。 (3)未成熟裂殖體：注意蟲體變化，細胞質(zhì)特點，核的數(shù)目，瘧色素分布。 (4)成熟裂殖體：注意核分裂數(shù)目，細胞質(zhì)是否已隨之分裂，裂殖子排列情況，瘧色素分布情況。 注意事項： 1、瘧原蟲甚小，且在紅細胞內(nèi)，受感染紅細胞的比例也少，一般被間日瘧原蟲侵襲的紅細胞不超過1%，故需耐心地查找。 2、在油鏡下尋找與觀察蟲體形態(tài)時，滴油不可過多，以免損壞鏡頭與標(biāo)本。 3、注意染料渣質(zhì)與瘧原蟲的區(qū)別：瘧原蟲必須具備紅色的核質(zhì)部分和藍色的細胞質(zhì)部分，除環(huán)狀體外還可見瘧色素，染料渣則無上述特點。 4、注意大滋養(yǎng)體與配子體的區(qū)別。 5、淋巴細胞與瘧原蟲的區(qū)別：淋巴細胞的細胞核大多數(shù)是圓形，核大，有顯著的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而淺藍色的胞質(zhì)很少，無瘧色素。 二、示教標(biāo)本 1、薄血膜中間日瘧原蟲紅細胞內(nèi)各期(環(huán)狀體、大滋養(yǎng)體、成熟或未成熟裂殖體、雌或雄配子體)(油鏡)。 2、薄血膜中惡性瘧原蟲紅細胞內(nèi)的環(huán)狀體、雌或雄配子體(油鏡)。 3、子孢子 三、操作 薄血膜的制作及染色 1、取血 小鼠：將伯氏瘧原蟲(Plasmodium berghei)保種的小白鼠的尾部末端剪去，將血滴置于載玻片一端。 2、推片和染色 1)取邊緣平滑的另一載玻片作推片，以左手持載玻片的兩端，右手持推片中段兩側(cè)，將推片一端的邊緣置于血滴上，使血液沿推片端邊緣展開。 2)使兩玻片呈30—45度角，將推片向另一端推動，推成均勻的薄血膜。血量適度、推的方向一致、用力均勻是推片成功的關(guān)鍵。放置待干后，用蠟筆在血膜兩端劃線以防染液外溢。 3)用吸管吸取瑞氏(Wright)染液，滴5—10滴于血膜上，使其覆蓋全部血膜。 4)經(jīng)30秒鐘后，滴加等量的緩沖液，使之與染液混勻。 靜置染色5—10分鐘后(注意不使染液干燥)，用清水輕輕將染液沖去。沖洗前切勿先傾去染液，以免染料顆粒沉著。 5)血片斜置，待干后用油鏡觀察。 3、觀察效果 好的標(biāo)本在油鏡下觀察可見到紅細胞平鋪，無重迭現(xiàn)象。白細胞核呈紫藍色，血膜上無染料殘渣沉著，表明染色良好。本次實驗經(jīng)染色的鼠血薄血膜中鼠瘧蟲數(shù)量多，被寄生的紅細胞明顯脹大，常見紅細胞內(nèi)有多個瘧原蟲寄生，瘧原蟲細胞質(zhì)呈藍色，核為紅色。 4、注意事項 1)載玻片應(yīng)潔凈無油污，以免血膜上產(chǎn)生空泡樣的空白區(qū)。 2)推片的邊緣要平整光滑，推力要均勻，中途不能停頓，以免血膜厚薄不勻。 3)涂成的血膜讓其自然干燥，切勿加熱或曝曬，以免影響染色效果。 4)加緩沖液時要充分混勻，染色后用流水緩慢沖去染液，避免染料殘渣沉著在血膜上。厚血膜制作：詳見教材實驗技術(shù)篇附：厚薄血膜的優(yōu)缺點： 用薄血膜觀察瘧原蟲，可保持完整的紅細胞，有助于鑒別蟲種，但瘧原蟲數(shù)量較少，需細心尋找。厚血膜取血量多，蟲體集中，檢出率高，但溶血后的紅細胞失去完整形態(tài)，只剩下瘧原蟲和瘧色素，無經(jīng)驗者不易識別。故為了取長補短，在流行病學(xué)調(diào)查時，一般采用在同一張玻片上作厚薄兩種血膜。 作業(yè)： 以彩色筆繪間日瘧原蟲紅內(nèi)期的各期形態(tài)圖，并注明結(jié)構(gòu)。 思考題： 1、瘧原蟲的基本構(gòu)造有哪些?紅內(nèi)期有哪些形態(tài)? 2、間日瘧原蟲紅內(nèi)期各期的形態(tài)特征有哪些? 3、怎樣做好厚、薄血膜?兩種血膜查瘧原蟲各有哪些優(yōu)缺點?用瑞氏或吉氏染色法各應(yīng)注意什么事情?為什么? 5 ...
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