�。�3)ABC法的評價及實驗注意事項
ABC法具有：①敏感性強：Hsu等應(yīng)用ABC法與PAP法相比發(fā)現(xiàn)敏感性較PAP法高20～40倍能顯示PAP法所不能顯示的抗原。這是因為生物素與抗生物素間有較強的結(jié)合力，一個抗生物素分子具有可與生物素結(jié)合的4個活性部位，其中一部分可與生物素標(biāo)記的過氧化物酶相結(jié)合，另一部分可與生物素標(biāo)記的免疫球蛋白結(jié)合。生物素通過氨基與抗體或過氧化物酶分子相結(jié)合，一個過氧化物酶或免疫球蛋白分子可以結(jié)合多個生物素分子，從而增加了免疫球蛋白或過氧化物酶結(jié)合抗生物素的能力。在ABC反應(yīng)中，抗生物素作為橋連接于生物素標(biāo)記的酶和生物素標(biāo)記的抗體之間，而生物素標(biāo)記的過氧化物酶分子又可作為橋連接于抗生物素分子之間，于是形成了一個含有3個以上過氧化物酶分子（大于PAP復(fù)合物)的網(wǎng)格狀復(fù)合物，敏感性極大提高。②特異性強，背景染色淡：由于敏感性高，第一抗體和第二抗體都可被稀釋至盡可能的高度，減少了非特異性染色。③方法簡便，節(jié) 約時間：由于ABC法敏感，操作的抗原抗體反應(yīng)的時間可由PAP法所需的數(shù)天縮短為2h左右，各層抗體作用僅需15min。④國內(nèi)上海生物制品所等單位制備的生物素—抗生物素染色藥盒經(jīng)質(zhì)量鑒定符合標(biāo)準(zhǔn)，已提供國內(nèi)市場。⑤由于生物素與抗生物素具有和多種示蹤物結(jié)合的能力，可用于雙重或多重免疫染色。
實驗注意事項：
①內(nèi)源性生物素活性及其消除：生物素是一種輔酶，是在脫羧基酶、羧基轉(zhuǎn)換酶等催化的代謝環(huán)節(jié) 中所產(chǎn)生的羧基的中間載體，它存在于某些組織和細胞內(nèi)，在應(yīng)用ABC染色時會與抗生物素結(jié)合而產(chǎn)生非特異性染色。因此，對抗生物素結(jié)合性較高的組織如肝、腎、白細胞、脂肪組織和乳腺，在應(yīng)用ABC方法前應(yīng)預(yù)先以0.01%的抗生物素和0.01%的生物素溶液分別作用20min左右，以消除內(nèi)源性抗生物素結(jié)合活性，每次作用后用PBS洗5min，更換3次。Nar－itoku和Taylor（1982)報告神經(jīng)組織中的乳糖可與抗生物素結(jié)合產(chǎn)生假陽性反應(yīng)，以2—甲基-O-甘露糖預(yù)孵育切片可封閉神經(jīng)組織內(nèi)乳糖分子上的結(jié)合點，從而阻止與抗生物素蛋白的結(jié)合。必要時，也可用0.3%H2O2—100%甲醇孵育以消除內(nèi)源性過氧化 物酶活性。
�、谏锼刂苿┲g相互親合性差異大，因此在應(yīng)用ABC試劑時，應(yīng)注意廠家和批號，對購進試劑應(yīng)進行事先測試，以保證實驗結(jié)果的穩(wěn)定性。
�、跘BC試劑保存溫度以4℃為佳，據(jù)報告保存可達兩年之久，仍能獲得滿意效果，而在—20℃生物活性在短期內(nèi)即被破壞。
2．橋抗生物素—生物素技術(shù)（Bridged Avidin –Biotin technique, 簡稱BRAB技術(shù))
該技術(shù)方法是用生物素分別標(biāo)記抗體和酶，然后以抗生物素為橋，把兩者連接起來（圖6-2)。
圖6-2B RAB技術(shù)
檢查抗原時，先用生物素標(biāo)記的抗體與細胞（或組織內(nèi))的抗原反應(yīng)，洗去未結(jié)合的抗體，加入抗生物素孵育后，洗去未結(jié)合的抗生物素，再加入已標(biāo)記酶的生物素孵育，洗片，以細胞化學(xué)方法呈色反應(yīng)。
3．標(biāo)記生物素—抗生物素技術(shù)（Labelled Avidin—Biotin technique, LAB技術(shù)) 以生物素標(biāo)記抗體作第一抗體，酶標(biāo)記抗生物素作為第二抗體（圖6-3)。操作步驟如下：
圖6-3 LAB技術(shù)
�。�1)切片在含有25～50μg/ml生物素標(biāo)記抗體（PBS液稀釋)中孵育1h，室溫。
�。�2)PBS洗2次，每次5min。
�。�3)用20～50μg/ml過氧化物酶標(biāo)記的抗生物素液孵育90min，水洗。
�。�4)酶呈色反應(yīng)。
BRAB法和LAB示是Guesdon及其同事們（1979)建立的，由于這二種方法都需以生物素標(biāo)記第一抗體，應(yīng)用不如ABC法普遍。但用于免疫細胞中免疫球蛋白的顯示具有特異性。二者比較，LAB法手續(xù)較簡便，但靈敏度較低。
生物素—抗生物素染色法采用免疫細胞化學(xué)染色中各種常用固定劑（見附錄)，均可獲得較滿意的結(jié)果。但有實驗報告推薦“PLP”固定液（即過碘酸—賴氨酸—多聚甲醛固定液)，其配制法亦見附錄。PLP固定后，依次經(jīng)系列蔗糖磷酸緩沖液（10%，15%，20%各5min)，進行冰凍切片，貼于載片上，置室溫風(fēng)干30min或37℃3～4h或過夜。染色前用PBS濕潤水化切片，可獲得滿意染色效果。
